循环肿瘤细胞在肺癌中的表达及其临床意义研究

骆许静 马耀先 孙 桢 方晓瑞 申晓燕

肺癌是1种全世界范围内常见的恶性肿瘤，它起源于支气管黏膜及腺体，发病率极高，其发病率及死亡率高居恶性肿瘤之首，并且其发病率逐年升高[1]，2017年的研究数据表明，全国恶性肿瘤发病第1位的是肺癌，每年新发病例约73.3万[2]。目前，传统诊断有局限性[3]，不能检测到循环血液中的癌细胞和其他器官中的微小转移灶，许多患者因远处器官和组织的转移而复发，部分初期肺癌将会发展为晚期的肺癌，给患者带来极大的痛苦。早发现、早诊断、早治疗，提前控制病情是治疗肺癌有效方法，但由于该疾病前期症状不明显，亟需1种灵敏的诊断方法[4]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是从原发肿瘤或者转移灶上脱落后进入血液循环的肿瘤细胞，CTC在肿瘤的研究中得到广泛的应用[5]，CTC逐渐体现出多种癌症诊断方面的价值[6]。研究显示[7-8]， CTC检测在肺癌中也表现较好的敏感性和特异性。本研通过CTC检测与临床相结合，探讨CTC检测对诊断肺癌疾病及其转归的临床价值，以期CTC能够在肺癌诊断、治疗和预后评估中得到更广泛的应用，为医学界同仁提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料

肺癌患者组：选取自2016年3月至2017年5月在我院就诊的60例肺癌患者,其中男性26例,女性34例，平均年龄为62.2岁，38～80岁。纳入标准：①经胸部CT扫描及其他组织病理学检查确诊为肺癌患者；②年龄在18～80岁；③入组前未接受任何抗肿瘤治疗。非结核的肺良性疾病患者组：选取自2016年3月至2017年5月在我院就诊的10例肺良性疾病患者，其中男性7例，女性3例，平均年龄为61.9岁，37～80岁。纳入标准：①病理学检查排除肺恶性肿瘤；②符合非肿瘤相关疾病临床诊断标准；③有微生物学或组织学证据。另选取健康志愿者10例，男性6例，女性4例，平均年龄为53岁(28～69岁)。三组受试者在性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均签署了知情同意书,经伦理委员会审查通过。根据胸部CT、B超和纤维支气管镜的临床检测结果，其中小细胞肺癌患者11例，非小细胞肺癌患者49例；依据第八版国家肺癌TNM分期标准，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期12例。

1.2 方法

首先采集所有患者静脉血7.5 ml，加入到ACD抗凝试管。加入6.5 ml磷酸盐缓冲液混入其中，充分摇匀，以2000 rpm室温离心15 min，离心3次。将富积到的细胞均匀涂在玻片上，使用抗体混合液(人鼠抗Pan-细胞角蛋白CK，生产厂家:上海宾智生物科技有限公司)和封片液(4，6-二脒基-2-苯基吲哚购自invitrogen公司)染色。最后采用免疫荧光显微镜(购自雅培公司)进行观察，查找肿瘤细胞。以对数生长的肺腺癌A549细胞株为阳性对照组，以PBS代替一抗为阴性对照组，防止样本出现异常现象，如样本红细胞裂解不完全导致成团、样本红细胞裂解后溶血。整个过程注意无污染、避光操作。

1.3 CTC的判定标准

形态学标准：①细胞呈圆形、椭圆形或长形，体积明显大于血细胞；②光镜下可见完整细胞形态。CTC免疫荧光染色结果判定：可以同时被CK和DAPI染色，不能被CD45染色。目前尚无国际标准化的阳性判定标准，本试验以见到CTC即为阳性结果。出现阳性结果的患者在整个组中的比率即为阳性率。

1.4 统计学方法

应用SPASS 20.0软件对获得的实验数据进行统计分析，计量组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌患者组、良性肺疾病患者组和健康空白对照组中CTC数量统计结果

肺癌患者组中CTC阳性率达80%(48/60),在良性肺疾病患者组和健康空白对照组中CTC阳性率为零，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同类型肺癌及不同分期肺癌患者CTC阳性率的分析

不同的肺癌类型CTC阳性率比较发现，循环细胞的阳性率与性别、肺癌类型无明显关系(P>0.05),而Ⅰ期肺癌患者中CTC阳性率(40.00%)显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的CTC阳性率(85.71%、88.24%、100.00%)，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同类型及不同分期肺癌患者CTC阳性表达情况(例，%)

3 讨论

近年来肺癌的发病率不断升高，肺癌转移与扩散也越来越复杂，传统的肺癌检测手段精确度与灵敏度受到一定的挑战，临床上频繁出现肺癌的误诊情况[9-10]，不断有研究者对传统的诊断手段提出质疑，并且传统的检查方法很容易对患者造成有创伤害。为了能够减少临床误诊情况，更加合理的对肺癌患者进行诊断、治疗、预后评估，需要综合运用多种检测技术对患者进行多角度、全方位、深层次的诊断[11]。检测肺癌患者血液中循环肿瘤细胞手段作为一种新的肺癌的判断方法越来越受大家重视，是目前临床研究的热点[12]。CTC的检测手段已在乳腺癌中得到广泛的应用[13]，其符合率达到95%～100%，并且对卵巢癌、晚期直肠癌和前列腺癌的诊断、治疗、预后评估具有指导作用[14]。随着Ficoll离心法和免疫磁珠法等CTC富集技术，流式细胞计数和聚合酶联反应等CTC鉴定技术以及CTC芯片技术的应用[15]，CTC的检测的敏感性和特异性越来越高[16-17]。若这些新技术的能广泛应用于临床，将会极大有助于肺癌的诊治和预后判断，预测肺癌的转移情况，尽早采取有效的治疗措施，提高肺癌患者的存活率。

我们通过对60例肺癌患者、10例良性肺疾病患者、10例健康对照着中外周血CTC的数量进行研究，统计结果显示肺癌患者的CTC阳性率明显高于良性肺疾病和健康对照组。并对不同性别和不同肺癌类型的CTC阳性率进行比较，其差异不具有统计学意义(P>0.05)，而不同肺癌分期的CTC阳性率差异具有统计学意义(P<0.05)。此研究结果与陈燕、钟光华等人的研究结果基本一致[18-19]。说明CTC检测具有一定的稳定性、准确性和可重复性。但是CTC的评判标准和方法并未统一，为CTC检测的广泛应用带来一定困难，因此进一步提升肺癌中CTC检测的临床应用价值对肺癌患者的诊断、治疗和预后评估具有重大的临床意义。