Survivin及EGFR在甲状腺癌及非癌组织中表达差异性及机制分析

陈 成 石朋飞 朱俊玲 丁洪琼

甲状腺癌的手术治疗取得了显著疗效，但是对于转移或者低分化患者疗效较差[1-3]。EGFR属于酪氨酸激酶受体的1种，EGFR磷酸化和二聚体化后，下游的磷酸肌醇激酶被激活，提供信号转导分子和亲和位点产生转导下游，高亲和信号，参与有丝分裂[4]。Survivin是目前发现最小的凋亡抑制蛋白家族的成员，具有强大的抗凋亡作用，在肿瘤组织中呈现高表达性，对提示抗细胞凋亡作用与细胞癌变存在密切的关系。研究表明，Survivin在甲状腺癌中普遍表达，并与肿瘤的转移、分化等恶性生物学密切相关[5]。本实验通过对甲状腺癌及肺癌组织中EGFR和Survivin的表达的研究，旨在探究两者在甲状腺癌发生和发展过程中的作用，以及其相关性和意义。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2017年1月至12月在本院接受治疗的甲状腺癌患者病例存档，从中选取有完整临床资料的甲状腺癌样本300例，样本甲状腺组织来自全甲状腺切除病例，确定两侧腺叶分别为非癌组织和甲状腺癌组织。取600例癌侧组织(同部位取两份分为A-300组、B-300组)定为实验组，取600例非癌侧组织(同部位取两份分为a-300组、b-300组)定为对照组。所有标本术前均未接受化疗、放疗及内分泌治疗。所选300例样本中，髓样癌23例，滤泡状癌45例，乳头状癌232例；男性90例，女性210例。年龄在26～74岁之间，平均年龄为(45.76±12.19)岁；按照最新甲状腺癌病理分期：Ⅰ期165例，Ⅱ期53例，Ⅲ期60例，Ⅳ期22例，无淋巴结转移202例，伴有淋巴结转移98例。

1.2 主要仪器和试剂

仪器：石蜡包埋机，日本OLYMPUS公司；切片机，德国LEICA RM2255公司；电热恒温水浴箱，上海圣科公司；光学显微镜，日本OLYMPUS公司；低温水箱，中国海尔电器有限公司；电磁炉，中国苏泊尔电器；不锈钢高压锅，中国苏泊尔电器。

试剂：兔抗人EGFR单克隆抗体，德国Bioworld公司；免疫组化PV试剂盒，中国中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人Survivin单克隆抗体，德国Bioworld公司；浓缩DAB试剂盒，中国中杉金桥生物技术有限公司；苏木精染液，台湾BASO公司；枸橼酸盐抗原修复液，中国中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

对所选实验组和对照组样本采用免疫组化PV法进行研究，得出其Survivin和EGFR表达情况。从而得出甲状腺癌患者Survivin表达与EGFR之间的关系。

1.4 Survivin和EGFR免疫组化染色

1.4.1 Survivin免疫组化染色步骤 将选取的蜡块标本切成厚度为4 μm的切片，实验组取甲状腺癌侧组织600张切片，平均分为A、B两组；对照组取非癌侧相邻组织600张切片，平均分为a、b两组。用二甲苯溶液将(A、a)组浸洗两次，再用梯度乙醇依次浸洗1次；每5 min用PBS溶液漂洗，持续3次；修复抗原20 min，待其冷却；再次使用PBS溶液每5 min漂洗1次，持续3次；将切片擦干，滴加浓度为3%的双氧水，在37 ℃的恒温水浴箱中放置30 min；每5 min用PBS溶液漂洗，持续3次；滴加一抗，置于4 ℃冰箱中过夜；取出切片，PBS溶液漂洗；将切片擦干，滴加二抗，37 ℃水浴40 min；每5 min用PBS溶液漂洗，持续3次；新鲜DAB工作液，显色在显微镜下观察20 s后终止反应；苏木精染色2 min，冲洗后再用分化液浸洗，反蓝浸洗；脱水后用中性树胶进行封片；使用PBS代替一抗进行对照。

1.4.2 EGFR免疫组化染色 取(B、b)组蜡块标本，使用二甲苯溶液浸洗5 min、2次；用梯度乙醇浸洗3 min、1次；PBS漂洗5 min、3次；滴加浓度为1%的双氧水甲醇溶液，置于室温下10 min，蒸馏水冲洗1次，PBS漂洗5 min、3次；在室温下滴加抗原修复液，10 min后再用PBS冲洗5 min、3次；在室温下滴加山羊血清封闭液，静置20 min后将多与液体甩去；滴加一抗，置于4 ℃冰箱中过夜；次日取出，滴加二抗置于37 ℃温度下20 min，用0.1 MPBS漂洗；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下静置20 min，用0.1 MPBS漂洗；DAB显色；苏木精染色，水洗后用浓度为1%的酒精盐酸溶液分化，氨水反蓝、水洗；脱水后用中性树胶封闭切片。

1.5 结果判定

Survivin和EGFR蛋白阳性表达主要在细胞质显色，阳性表达为棕黄色颗粒。阳性细胞百分率大于75%记为4分，50%～75%(含)为3分，25%～50%(含)为2分，5%～25%(含)为1分，小于5%(含)为0分；按照显色强度棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，未显色为0分；得分两项相乘。将得分由高到低划分等级，9分以上(+++)为高表达，5～8分(++)为中表达，2～4分(+)为低表达，0～1分为(-)阴性表达。本研究将高、中、低表达判定为阳性表达。

1.6 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差来表示。组内数据用t检验，组间对比应用one-way anova分析，若方差不符合比较要求则用组组对比比较。计数资料采用χ2检验。P>0.05 差异无统计学意义。

2 结果

2.1 检测Survivin在甲状腺癌和甲状腺非癌组织中的表达

Survivin在对照组及TC病理分型的阳性表达率分别为10%和57.67%，差异有统计学意义(χ2=19.89，P<0.05)。不同TC病理分型下病理组织甲状腺癌中，其阳性表达率髓样癌(MTC)为100%，滤泡状癌(FTC)为68.89%，乳头状癌(PTC)为53.88%，差异无统计学意义(χ2=3.387，P>0.05)。详见表1。

2.2 临床病理因素与Survivin的关系

甲状腺癌中不同性别、年龄、病理组织类型的Survivin阳性表达率相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；甲状腺癌组织中无淋巴结转移与有淋巴结转移的Survivin的阳性表达率相比较，差异有统计学意义(P<0.05)；甲状腺癌临床分期中，Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期Survivin阳性表达率相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表1 Survivin在甲状腺非癌组织和癌组织中的表达/例

注：*为P>0.05，PTC、FTC、MTC相互比较。

表2 临床病理因素与Survivin的关系(例，%)

2.3 EGFR在甲状腺非癌组织和癌组织中的表达

EGFR在甲状腺癌组织和甲状腺非癌组织中，阳性表达率分别为65%和15%，差异有统计学意义(P<0.05)；甲状腺癌不同组织学类型中，EGFR阳性表达率，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 EGFR在甲状腺非癌组织和癌组织中的表达/例

注：*为P>0.05：PTC、FTC、MTC相互比较。

2.4 临床病理因素与EGFR的关系

甲状腺癌中，不同性别、年龄、病理分型、临床分期其EGFR阳性表达率相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；甲状腺癌组织中EGFR阳性表达率在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 临床病理因素与EGFR的关系(例，%)

2.5 EGFR和Survivin在甲状腺癌组织中的关系

300例甲状腺癌样本中，共有173例Survivin阳性表达，127例Survivin阴性表达；共有195例EGFR阳性表达，105例EGFR阴性表达；两者共同阳性表达150例，共同阴性表达82例，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 EGFR和Survivin在甲状腺癌组织中的关系/例

3 讨论

恶性肿瘤各个阶段都受到不同因子和相关基因的调控，在其发生发展过程中，多因素调节、多基因参与、多阶段进行。甲状腺肿瘤发病率目前正以3%的速度高速增长，居头颈部肿瘤首位[6-9]。研究表明，Survivin和EGFR在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用；EGFR在转导介导细胞信号中通过调节细胞增殖、分化发挥重要作用，在肿瘤组织中，二者呈现高表达性[10]。

研究表明，肝癌、肾癌、淋巴瘤等多种肿瘤的病理分期与恶性程度与Survivin的表达有关[11]。本实验结果提示Survivin通过抑制细胞凋亡，进而引起细胞异常存活、分裂，导致发生甲状腺癌。EGFR通过酪氨酸激酶性介导细胞信号转导，调节细胞增殖、分化，调节细胞周期，做出相应的生活学反应，抑制或调节细胞周期，使其发展形成肿瘤。研究表明，EGFR高表达于甲状腺癌组织中，且与淋巴结转移、肿瘤组织学程度、临床分期有关，可提示肿瘤侵袭性的强弱，在临床手术及预后中其表达水平是重要标志物之一[12-13]。Survivin与EGFR作用途径不同，研究表明，二者在肿瘤组织中表达均高于正常组织。本实验结果提示甲状腺癌细胞的生长、浸润和转移是多因素共同作用的结果，对各指标的检测对靶向治疗和预后有指导意义[14-16]。当Survivin和EGFR表达为阳性时，甲状腺组织学虽为良性，但是组织细胞仍存在较大癌变可能，手术中建议完全切除此种组织。EGFR和Survivin共同阳性表达患者易发生淋巴结转移，建议先清扫淋巴结[17]。这对于甲状腺癌患者选择手术方式有很大帮助。

综上所述，甲状腺癌组织中Survivin和EGFR阳性表达率明显高于甲状腺非癌组织，二者可作为甲状腺肿瘤良恶性的指标两者协同促进甲状腺癌的发生、发展。