甲状腺微小乳头状癌术中冰冻病理诊断研究及B-raf基因检测意义

邱 娟

甲状腺微小乳头状癌是常见的甲状腺恶性肿瘤，在甲状腺恶性肿瘤中占比最高[1]，近年来其发病率上升趋势明显。甲状腺微小乳头状癌具有病灶较小、发病区域隐匿及症状表现不明显等特点[2-3]，早期易误诊与漏诊，因此提高甲状腺微小乳头状癌的诊断准确性对提升患者的诊治效果具有重要临床意义。另外有研究提出，B-rafV600E基因的突变可能与肿瘤的侵袭性有关[4]，应用B-rafV600E基因突变检测可提高甲状腺微小乳头状癌的诊断准确性，同时可利用B-rafV600E基因检测的特异性来预测甲状腺微小乳头状癌疾病的恶型性，对提高疾病的诊治效果及指导手术方案的制定具有重要作用。本次研究为了对提高甲状腺微小乳头状癌患者的诊断效果提供更多有效依据，对我院收治的168例甲状腺微小乳头状癌患者行术中冰冻病理诊断并与石蜡切片病理结果进行对比，同时将其按照基因检测分型进行临床资料对比，分析B-rafV600E基因检测意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年12月我院收治的168例甲状腺微小乳头状癌患者作为研究对象，其中男性37例、女性131例，年龄26～69岁，平均年龄为(42.6±8.8)岁，病灶大小在0.15～1.3 cm之间，平均病灶大小为(0.71±0.11)cm，其中单侧病灶患者112例、双侧病灶患者56例。

1.2 纳入标准

所有患者均经石蜡切片病理检查确诊为甲状腺微小乳头状癌并符合相关诊断标准[5]，患者术前未接受过药物、手术及放射等治疗；经常规辅助检查未发现有颈部淋巴结肿大及远处转移征象患者；排除不符合上述标准及中途退出研究等患者，本次研究经相关医学伦理委员会批准，患者及家属均知情并签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 术中冰冻病理诊断方法 将患者手术切除的新鲜甲状腺组织作为标本，对其行间隔书页状平行切开[6]，间隔距离0.2 cm，由专业诊断医生对标本进行详细观察，发现异常后可使用指腹行触摸检查，确定病灶后对病灶行最大面取材，如果病灶存在钙化现象，先给予脱钙剂处理，再行切片处理，随后置于-22 ℃～-24 ℃冰冻切片机内，固定染色后使用重型树胶封片，并进行光镜检查。

1.3.2 B-rafV600E基因检测方法 取患者10～25 mg病灶标本，剪碎后置于1.5 ml离心管中，加入180 μl Buffer ATL、20 μl 蛋白酶K后充分混匀，随后将离心管置于56 ℃下进行震动消化过夜。第2天将震动消化过夜的离心管进行漩涡处理，随后将混合液置入收集柱中并加入200 μl Buffer AL、200 μl乙醇充分混匀，随后进行1 min离心处理，完成后将混合液移入2 ml收集管中并加入500 μl Buffer AW1，行漩涡及离心处理，对处理好的混合液移入新收集管中并加入10 μl Buffer AE并置于温室5 min，随后在进行离心处理并重复洗脱3次。对提取成功的DNA采用美国生产的ABI7500设备及B-rafV600E基因突变检测试剂盒进行检测，严格按照试剂盒使用说明执行检测操作。

1.4 判断标准

术中冰冻病理诊断分为确诊、误诊、漏诊及延迟诊断4个标准[7]，其中确诊为术中冰冻病理检查出甲状腺微小乳头状癌；误诊为检查结果呈假阴性；漏诊为术中冰冻病理诊断未取到病灶；延迟诊断为术中病理诊断结果疑似为甲状腺微小乳头状癌、需进行石蜡切片诊断做进一步确诊。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 甲状腺微小乳头状癌术中应用冰冻病理诊断的检出率

研究结果显示，168例甲状腺微小乳头状癌患者经术中冰冻病理确诊138例，检出率为82.1%；误诊15例、误诊率为8.9%；漏诊8例、漏诊率为4.8%；延迟诊断7例、占比4.2%。冰冻病理检出率(82.1%)与石蜡切片病理确诊率(100%)存在明显差异，差异具有统计学意义。

2.2 甲状腺微小乳头状癌患者的B-raf基因结果对比

研究结果显示，168例甲状腺微 小乳头状癌患者中B-rafV600E基因为突变型有126例、野生型有42例。2种基因类型患者在肿瘤大小、是否伴有慢性淋巴性甲状腺炎上存在明显差异(P<0.05)；而在性别、年龄、是否有家族史、是否伴有淋巴结转移及临床分期上无明显差异(P>0.05)。见表1。

3 讨论

术前细针穿刺细胞学检查及术后石蜡切片病理学检查均被临床认为是甲状腺微小乳头状癌诊断的“黄金标准”[8]，但实践中我们发现术前细针穿刺细胞学检查仍存在假阴性的诊断结果，考虑原因是甲状腺微小乳头状癌结节过小导致穿刺定位精准性受到影响，从而影响标本质量，也可能与诊断医生的经验不足有关，因此本次研究将术后石蜡切片病理学检查结果作为对比对象。以上2种诊断方式效果确切，但也存在各自的局限性[9]，所以术中冰冻病理诊断这种具有检查时间短、准确率较高的诊断方式拥有较大的应用空间[10]，由于甲状腺微小乳头状癌的诊断会影响术式的选择及患者预后等，因此分析术中冰冻病理诊断甲状腺微小乳头状癌的准确性具有重要临床意义。本次研究对168例经术后石蜡切片确诊为甲状腺微小乳头状癌患者行术中冰冻病理诊断发现，168例甲状腺微小乳头状癌患者经术中冰冻病理确诊138例、检出率为82.1%，提示术中冰冻病理诊断虽然无法达到石蜡切片检查的准确性，但检查准确性也相对较高，对甲状腺微小乳头状癌的诊断有一定指导意义。而对本次研究术中冰冻病理诊断的误诊、漏诊进行原因分析，发现切片不当、温度不当、固定不当及染色不当是造成误诊、漏诊的主要原因，因此我们几点措施以提高术中冰冻病理诊断在甲状腺微小乳头状癌诊断中的准确性：①患者应完善术前各项辅助检查，诊断医生应对患者资料深入了解，尽可能在术前发现微小病灶；②取材、切片时应谨慎小心，对可疑的组织要全面检查；③术中取材时应减少对腺体造成的破坏。

表1 甲状腺微小乳头状癌患者的B-raf基因结果对比(例，%)

Raf信号通路的作用是通过将细胞表面的受体信号转换至细胞核内[11]，从而对细胞的分化、增殖及存活等起引导作用[12]，B-rafV600E突变是最常见的基因突变[13]。临床有研究显示[14]，将B-raf基因检测技术应用于穿刺组织检查中可对评估患者预后、制定手术方案及实现风险评估与个体化治疗等提供可靠依据，但也有学者不支持该观点[15]，因此关于B-raf基因检测与疾病病理因素是否存在相关性国内外学者均作了大量研究，但结果并不统一。本次研究结果发现，突变型与野生型2种基因类型患者在肿瘤大小、是否伴有慢性淋巴性甲状腺炎上存在明显差异，而在性别、年龄、是否有家族史、是否伴有淋巴结转移及临床分期上无明显差异，因此我们认为B-rafV600E基因突变可以作为甲状腺微小乳头状癌诊断的有效指标，也可以作为影响患者预后的独立因子。

综上所述，术中冰冻病理诊断应用于甲状腺微小乳头状癌检测中具有重要作用，且多种干预措施的应用可提高冰冻病理诊断准确率。B-rafV600E基因与甲状腺乳头状癌患者的肿瘤大小及是否伴有慢性淋巴性甲状腺炎有关，因此检测B-rafV600E基因可为甲状腺乳头状癌的防治提供更多参考依据。