脑转移癌患者免疫组化与电镜特征及局部血脑屏障变化的临床意义

汪 逵 邓民强 魏 文 周 晗 李元红

脑转移癌又称颅内转移瘤，指原发于机体其他部位的肿瘤转移至颅内，颅内肿瘤中有3.5%～10%为脑转移瘤，恶性肿瘤患者中有25%～35%在其患病过程中出现脑转移症[1-2]。脑转移瘤可随时在患者患原发肿瘤的过程中表现出体征和症状，病程较短，病情在发病后呈进行性加重。血脑屏障可以阻止血液中的有害物质进入脑组织[3]，对脑组织内环境的稳定起到至关重要的作用，对中枢神经系统维持正常的状态具有十分重要的意义。研究表明转移的癌组织能够表达大量的血管内皮细胞生长因子，达到形成新生血管组织的目的，但是新生的血管组织因缺乏血脑屏障而会引起血浆成分渗漏[4-5]。脑原发肿瘤与脑转移瘤对于治疗呈现不同的反应，在脑转移癌的治疗中，水溶性药物可取得与患者原发病灶几乎相似的疗效。本研究通过对脑转移癌患者电镜特征和免疫组化的探讨，来阐明其局部血脑屏障变化的临床意义。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 免疫组化标本 选取2014年12月至2017年12月在本院接受治疗的16例脑转移癌患者的标本蜡块，肺癌为原发病14例，其病理类型为：1例腺鳞癌，7例小细胞癌，2例鳞癌，4例腺癌；肝细胞癌为原发病1例；乳腺浸润性导管癌1例。随机选取16例同时期在本院接受治疗的脑胶质瘤患者术后标本蜡块作为对照，其病理分级为：4例Ⅰ～Ⅱ级，10例Ⅱ～Ⅲ级，2例为多形性胶质母细胞瘤(Ⅳ级)。

1.1.2 电镜标本 选取2014年12月至2017年12月在本院神经外科接受治疗进行脑肿瘤手术切除的患者新鲜标本共6例，其病理类型为：4例脑转移癌，其中1例低分化腺癌，2例肺癌，1例低分化鳞癌；2例脑胶质瘤；1例乳腺浸润性导管癌，1例肝细胞癌。所选病例标本的病理分级均为Ⅱ～Ⅲ级。

1.2 实验试剂

主要试剂为神经元特异性烯醇化酶(NSE)、抗鼠抗人-神经胶质纤维酸性蛋白(抗鼠抗人GFAP)、S-100蛋白、NF、兔抗人SYN、NF、MBP、FV-Ⅲ、CD34。SP试剂盒均有福建迈新生物技术公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化法 ①烤片，将石蜡切片在68 ℃的温度下处理20 min；②脱蜡和水化，使用二甲苯溶液将石蜡切片脱蜡，梯度酒精脱水；具体步骤为：二甲苯Ⅰ20 min--二甲苯Ⅱ20 min--浓度为100%酒精溶液Ⅰ20 min--浓度为100%Ⅱ10 min--95% 5 min--80% 5 min--70% 5 min；③阻断灭活内源性过氧化物酶：浓度为3%双氧水在37 ℃的温度下孵育10 min，使用PBS重复冲洗5 min，冲洗3次；④抗原修复，将切片置于10 mmol/L的柠檬酸钠缓冲液(PH6.0)中，煮沸(15～20 min，95 ℃)，进行20 min以上的自然冷却至室温，PBS冲洗5 min，重复三次清洗；⑤在37 ℃的温度下正常羊血清工作液封闭10 min，倾去勿洗；⑥滴加一抗，在4 ℃温度下孵育，PBS反复冲洗5 min，重复冲洗3次，滴加生物素标记二抗，在37摄氏度温度下孵育30 min，PBS反复冲洗5 min，重复冲洗3次；⑦滴加辣根过氧化物标记的链霉素卵白素工作液，在37 ℃孵育30 min，用PBS重复冲洗5 min，重复3次；⑧H2O2/DAB反应染色，后反复冲洗苏木精复染，脱水封片。用PBS缓冲液代替一抗用来进行阴性对照，阳性对照使用迈新公司提供的阳性对照片。

1.3.2 制作电镜标本 ①前固定：首先将手术切除的标本使用浓度为2%的戊二醛在4 ℃的温度下固定2 h，然后每间隔2 h换0.1 M二甲胂酸钠缓冲液固定；②后固定：使用1%浓度的四氧化锇在4 ℃的温度下固定2 h，后每隔15 min使用0.1 M的二甲胂酸钠缓冲液冲洗2次；③脱水：按照如下步骤进行逐级脱水，(10 min 4 ℃ 30%酒精溶液)-(10 min 4 ℃ 50%酒精溶液)-(10 min 4 ℃ 70%酒精溶液)-(10 min 室温 80%酒精溶液)-(10 min 室温 90%酒精溶液)-(15 min 2次室温100%酒精溶液)-(15 min 2次室温环氧丙烷渗透)-【1 h室温 1∶1(不完全包埋液∶环氧丙烷)渗透】-【1 h 室温2∶1(不完全包埋液∶环氧丙烷)渗透】-(室温过夜万全包埋液渗透)；④包埋：(6 h 35 ℃温箱完全包埋液浸泡)-(48 h 60 ℃恒温箱 转移至包埋板)；修块后做半薄切片，将切片用甲苯胺染成蓝色，在光镜下选取完整的生长细胞，制备超薄切片，保证切片片厚为50～70 nm，铀铅染色后用型号为JEM-100的电镜观察。

1.3.3 结果判定标准 使用400倍视野在光镜下对每张切片随机选取100个目标结构细胞，按照阳性细胞比率和染色强度统计，结果阳性细胞或无染色>10%为阳性，阳性细胞和无染色≤10%为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差来表示。组内数据用t检验，组间对比应用one-way anova分析，若方差不符合比较要求则用组组对比。计数资料采用χ2检验。P>0.05为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 FV-Ⅲ和CD34的表达 脑转移癌组和脑胶质瘤组中，CD34和FV-Ⅲ均有丰富的表达，其表达相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。表明脑胶质瘤和脑转移癌组织中均建立有新生血管。如表1。

表1 FV-Ⅲ和CD34的表达(例，%)

2.1.2 GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN的表达 在脑胶质瘤组织中，GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN均强烈表达，但是在脑转移癌组中，几乎不表达GFAP、S-100、NSE、NF、MBP和SYN，提示脑转移癌中没有胶质膜成分，即没有形成血脑屏障的最基本的结构。几种标志物的表达2组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。如表2。

表2 2种组织中神经组织标志物的表达情况(例，%)

2.2 电镜扫描结果

电镜扫描结果表明，脑胶质瘤小血管出现明显增生，血管周隙出现明显胶质细胞终足包绕，内皮细胞出现部分变性，肥大且出现少量胶原纤维，下基底膜样物质显著增多。脑转移癌患者内皮细胞连结松紧不一，纤细疏松，部分间隙扩大，常见空泡变性，基底膜不均一且较薄，与胶质瘤相比毛细血管密度略少，毛细血管周围无胶质细胞终足，瘤细胞之间出现淋巴细胞浸润。

3 讨论

脑转移癌在恶性肿瘤其他器官转移中仅次于肝转移和肺转移，占第3位[6-7]。研究表明，转移的癌组织常表达大量血管内皮细胞生长因子，促进形成新生血管组织，导致血浆成分渗漏。脑转移病情严重，对患者生存质量造成重大影响，患者若不积极接受治疗，生存期只有4周左右。血脑屏障束缚了化疗治疗脑转移癌的确立，有研究表明化疗对原发病灶和脑转移有相似的疗效，提示血脑屏障在脑转移癌组织中可能遭到部分破坏，但是未见更详细的研究[8-10]。

研究表明，血脑屏障有以下特点：①毛细血管基膜是连续的；②毛细血管中其内衣细胞连接紧密；③毛细血管基膜外有胶质膜，胶质膜有胶质细胞终足形成。本实验得出S-100、NF、SYN、GFAP、NSE和MBP能够标志神经胶质细胞的微丝结构或终丝结构的标志物，其中GFAP可维持和形成星形胶质细胞突起，此类成分决定着血脑屏障中是否存在胶质膜成分[11-12]。本研究表明，FV-Ⅲ和CD34在脑胶质瘤和脑转移癌组织中均有丰富表达，表明脑胶质瘤和脑转移癌组织中都具有供血血管。基本上S-100、NF、SYN、GFAP、和MBP在脑转移癌组织中无表达，但是在脑胶质瘤中表达强烈，表明胶质膜成分在脑转移癌组织中不存在，即脑转移癌间质中，星形胶质细胞终足包绕的胶质膜在其血管壁周围无表达；NSE的部分表达与血脑屏障没有关系，只与原发病小细胞癌基本一致[13-16]。电镜观察表明，毛细血管内皮细胞在脑转移癌中连接不均一，还会出现炎性改变或空泡变性，不存在胶质细胞终足，基底膜在血管周围很薄。微小血管在肝转移病例中表达为窦样结构，表明其原发病灶与转移瘤血管特点相同，具有中枢神经的特点。上述结论表明，脑转移癌没有在其演变成转移灶的过程中形成完整的血脑屏障。

综上所述，在脑转移癌组织中，构成血脑屏障的基本物质神经胶质膜缺乏，血管内皮连接不紧密，即其组织中无完整的血脑屏障。