不同砧木嫁接番茄根系分泌物对青枯病菌和幼苗生长的影响

赵文宗 郑旭阳 张映卿 钟 川 阳燕娟 于文进

（广西大学农学院，广西南宁 530004）

青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，以下简称青枯病菌）引起的一种土传性维管束病害，常造成茄科作物的大面积萎蔫死亡。由于青枯病菌特有的生活习性和传播特性，使用常规的化学药剂难以防治，给番茄生产造成了极大的威胁（肖烨 等，2007；Tan et al.，2011）。采用抗病砧木嫁接技术来防控青枯病是当前最经济、有效的手段，可显著降低茄科作物的田间发病率，提高其抗病能力（张红浩 等，2015；赵曾菁等，2016；王岳霞 等，2018）。前人的研究表明，当植物根系受到病原菌侵染时，根部次生代谢物质的合成增加可以防御病原菌的侵袭（周宝利 等，2011）。根系分泌物是植物根部最主要的次生代谢产物，能够对土壤微生物（包括病原菌）和植物产生有益或有害的影响，与植物的抗病性密切相关（Yang et al.，2014）。

前人分别对黄瓜（韩雪 等，2006）、辣椒（耿广东 等，2009）、西瓜（郭尚 等，2010）、茄子（周宝利 等，2011）和大葱（徐宁 等，2012）等多种蔬菜的根系分泌物进行了研究，并分析了其中的化感成分。但嫁接番茄根系分泌物与抗青枯病的关系及其组分分析目前鲜有报道。因此，本试验采用水培的方法分别收集了砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物，探讨了根系分泌物对青枯病及其病原菌的抑制作用以及对番茄幼苗生长的影响，旨在为番茄青枯病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

接穗与砧木：供试品种均由广西大学农学院育成和提供。接穗为高感青枯病的樱桃番茄粉贝贝（Solanum lycopersicumvar.cerasiformecv.‘Fb’，以下统称自根番茄），砧木分别为高抗青枯病的番茄专用砧木番砧1号（Solanum lycopersicumcv.‘No.1’，简称番砧）和番茄、茄子通用砧木茄砧21号（Solanum melongenacv.‘No.21’，简称茄砧）。

青枯病病原菌（Ralstonia solanacearum）：从田间番茄青枯病发病植株上分离并进行纯化和保存，经鉴定具有较强致病力的青枯病菌作为接种用病原菌。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验于2018年7～9月在广西大学农学院蔬菜基地和人工气候室中进行。试验共设置5个处理，分别为接穗、砧木的自根苗（粉贝贝、番砧和茄砧）和砧穗嫁接苗（粉贝贝/番砧和粉贝贝/茄砧）。供试砧木用50孔穴盘播种，接穗用72孔穴盘播种，育苗基质按泥炭∶椰糠∶珍珠岩= 2∶1∶1的体积比配制（下同）。当砧木长至三叶一心时采用C型套管贴接法嫁接。嫁接成活后移苗至营养钵（80 mm×65 mm）中培养，待幼苗长至4～5片真叶时移至人工气候室中，设置室内光源光期16 h/暗期8 h，温度26 ℃/20 ℃（昼/夜），相对湿度60%～80%，统一进行水肥管理。取健壮幼苗培养至现蕾期，用于收集根系分泌物，每处理30株，3次重复，以灭菌去离子水作为对照（CK）。

1.2.2 根系分泌物的收集 参照杨国栋（2016）的方法并进行改进，各处理分别取长势基本一致的幼苗10株，将幼苗小心地从营养钵中取出，尽量避免伤根，分别用清水和去离子水充分洗去根上附着的基质。采用水培的方法收集根系分泌物，将10株幼苗一同栽培于装有500 mL去离子水的不透光惰性塑料小桶中，连续通气10 h培养后即得植株的根系分泌物粗收集液，重复3次，合并收集液，经定容、过滤后，统一用去离子水调整成相同浓度0.05 g·mL-1，保存于4 ℃条件下备用。

1.2.3 根系分泌物对青枯病菌的抑制作用 根系分泌物收集液经0.22 μm细菌过滤器过滤后，与2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基按1∶9的体积比制成混合培养基，以添加无菌水为对照。取0.1 mL经梯度稀释的青枯病菌菌液（浓度1×10-4CFU·mL-1）均匀涂布于混合培养基上，每处理3次重复，48 h后统计各皿菌落数，并计算相对抑菌率。

相对抑菌率=（对照皿菌落数-处理皿菌落数）/对照皿菌落数×100%

1.2.4 根系分泌物对青枯病和番茄幼苗生长的影响以高感青枯病番茄品种粉贝贝为试材，在72孔穴盘中播种育苗，待幼苗三叶一心后转至营养钵中培养。缓苗7 d后，用上述5个处理的根系分泌物进行灌根处理，每处理60株，每株20 mL，每隔3 d灌根1次，连续进行3次。灌根结束7 d后，将幼苗分为两部分，一部分用于接种试验，每处理30株，3次重复，采用伤根灌注法接种青枯病菌（浓度 5×108CFU·mL-1），每钵灌入菌液 15 mL；另一部分不接种，用于番茄幼苗生长试验，每处理选取长势一致的幼苗10株，测定其株高、茎粗、干鲜质量等指标，并求平均值。株高、茎粗和干鲜质量分别用直尺、游标卡尺和精密电子天平测定。

1.2.5 发病情况调查 接种病原菌后，每隔5 d调查1次植株的发病情况，共观察30 d。参照谢丙炎等（2010）的方法，根据植株发病情况将病情级别分为5级。0级：无症状；1级：1片叶萎蔫；2级：2～3片叶萎蔫；3级：除植株顶部2～3片叶外，其他叶片均萎蔫；4级：全株叶片萎蔫，植株死亡。

发病率=（发病株数/接种总株数）×100%

病情指数=∑（病情级别×该病级株数）/（病情最高级别×接种总株数）×100

1.2.6 根系分泌物的GC-MS分析 参照周宝利等（2011）的方法并进行改进，用乙酸乙酯对各处理的根系分泌物收集液按等体积进行萃取，连续萃取3次，合并有机相，经无水Na2SO4干燥后过滤，于40 ℃条件下旋转蒸干，并用对应有机溶剂复溶，样品经0.22 μm滤膜过滤后保存于4 ℃条件下备用。利用GC-MS（Agilent 7890A-5975C）对根系分泌物的组分进行分析。根据总离子流图，通过检索对比谱图库NIST08分析各组分中所含物质，并采用峰面积归一法确定各物质的相对含量。

气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），载气为 99.99% 的 He，流量 1 mL·min-1。进样口温度为250 ℃，基础柱温50 ℃，保持2 min，然后以6 ℃·min-1程序升温至250 ℃，保持15 min。进样量1 μL，不分流。质谱条件：利用电子轰击源（EI），设置轰击电压70 eV，离子源温度为230 ℃。采用全扫描模式，扫描范围M/Z 30～600 amu，扫描速度每点0.2 s。

1.3 数据处理与分析

应用Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行处理和作图，应用SPSS 20.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同根系分泌物对青枯病菌的抑制作用

砧木和嫁接番茄的根系分泌物均能对青枯病菌的增殖产生较好的抑制作用（图1）。不同处理间存在差异，其中抑菌效果最好的是粉贝贝/茄砧处理，相对抑菌率为13.36%；其次是粉贝贝/番砧和茄砧处理，均为10.53%；番砧处理最低，为7.69%。粉贝贝处理对青枯病菌的生长表现为促进作用，抑菌率为-10.32%，显著低于其他处理。

2.2 不同根系分泌物对番茄青枯病抗性的影响

由表1可知，施加粉贝贝的根系分泌物后，番茄青枯病的发病率和病情指数均与无菌水对照差异不显著。番砧和茄砧的根系分泌物对青枯病具有较好的抗病效果，发病率和病情指数均显著低于对照。粉贝贝/番砧和粉贝贝/茄砧的根系分泌物对青枯病也有较好的抗病效果，发病率和病情指数均明显低于对照，但高于相应砧木。

表1 不同处理的根系分泌物对番茄青枯病抗性的影响

2.3 不同根系分泌物对番茄幼苗生长的影响

砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物对番茄幼苗的生长存在不同的影响（表2）。砧木和嫁接番茄整体表现为促进作用；而自根番茄除对株高有一定的促进作用外，对其他指标影响不显著。其中，粉贝贝/番砧处理显著提高了番茄的株高，较对照增加了32.3%，其次为番砧处理，较对照显著提高了29.2%。番砧处理对番茄的茎粗促进效果最好，较对照显著增加了8.4%，其次是粉贝贝/番砧，较对照增加了6.8%。番砧和粉贝贝/番砧处理的根系分泌物对番茄地上部和地下部鲜质量均表现出显著的促进作用，优于茄砧和粉贝贝/茄砧处理。砧木和嫁接番茄对幼苗地上部和地下部干质量的影响不大。

表2 不同处理的根系分泌物对番茄幼苗生长的影响

2.4 不同处理根系分泌物的GC-MS分析

对自根番茄、砧木和嫁接番茄根系分泌物的乙酸乙酯组分进行分析（表3）。结果表明，该组分首次出峰时间在13 min左右，最后出峰时间在40 min左右，集中出峰时间为18～35 min。从根系分泌物中分离出烃类、酚类、酯类、醇类、醌类和酮类物质，其中酯类物质为主要成分，占比65.03%～85.42%，其次为烃类，占比10.38%～27.89%。相对含量较高的是1-十二烯、月桂烷、1-十四烯、十四烷、2，4二叔丁基苯酚、1-十六烯、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二（2-乙基己）酯、邻苯二甲酸二异辛酯等物质。不同处理间根系分泌物的组分存在差异，其中1-十八烯仅在粉贝贝中检出，2，6-二叔丁基苯醌则仅在嫁接番茄中检出，2，4-二叔丁基苯酚则在嫁接番茄中含量较高。与自根番茄相比，采用番砧和茄砧嫁接后，烃类物质相对含量分别降低了7.31%和3.27%。邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯等物质在抗病砧木自根植株和嫁接植株根系分泌物中的相对含量明显高于感病接穗自根植株，因此这些物质可能与嫁接诱导番茄抗青枯病有关。

表3 不同处理根系分泌物的组分分析

3 结论与讨论

根系分泌物是土壤中化感物质的重要来源，通过对植株、根际微生物包括病原菌的化感作用来调节病害的发生和发展（周宝利 等，2011）。不同种类或基因型品种的植物，其根系分泌物的组成和含量差异很大，同时与植物对土传病害的抗性密切相关（Strehmel et al.，2014；Zhang et al.，2014；Luo et al.，2015）。徐宁等（2012）认为大葱根系分泌物中含有酯类、酰胺类、酸类等物质，对枯萎病菌菌丝生长存在抑制作用，对黄瓜种子的萌发也存在一定的促进作用。本试验中，砧木和嫁接番茄的根系分泌物对青枯病菌的增殖均产生了显著的抑制作用，其中抑菌效果最好的是茄砧嫁接番茄，其次是茄砧和番砧嫁接番茄。番砧和茄砧的根系分泌物对青枯病具有较好的抗病效果，青枯病发病率和病情指数均显著低于对照。嫁接番茄的根系分泌物对青枯病也有较好的抗病效果，病情指数均显著低于对照，但高于相应砧木。2个供试砧木和嫁接番茄的根系分泌物对青枯病菌的抑制效果和对青枯病的抗性存在不一致的情况，可能是由于本试验中的根系分泌物为粗提物，其抑菌活性物质含量不同；砧穗互作也可能对结果产生了一定的影响，这一点仍需进一步验证。

砧木、自根番茄和嫁接番茄的根系分泌物对番茄幼苗的生长存在不同的影响，其中番砧和番砧嫁接番茄对幼苗株高和茎粗产生了明显的促进作用。供试砧木和嫁接番茄的根系分泌物有利于幼苗地上部和地下部鲜质量的提高，其中番砧和番砧嫁接番茄的效果较好，而自根番茄的根系分泌物则对幼苗的生长影响不显著。由此说明，砧木和嫁接番茄的根系分泌物改善了番茄幼苗对营养物质的利用，对其生长有较好的促进作用。

目前，对植物源活性物质的研究已成为热点和趋势，并取得了较大的进展（张兴 等，2015）。通过对根系分泌物乙酸乙酯组分进行GC-MS分析，检测到了烃类、酚类、酯类、醇类、醌类和酮类物质，酯类物质为主要成分。自根番茄和嫁接番茄根系分泌物的物质成分存在一定差异，嫁接番茄中烃类物质的相对含量要低于自根番茄，而2，6-二叔丁基苯醌仅在嫁接番茄的根系分泌物中检出。邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯在砧木和嫁接番茄根系分泌物中的相对含量明显高于自根番茄，2，4-二叔丁基苯酚在嫁接番茄的根系分泌物中含量较高。有研究表明，邻苯二甲酸等衍生物广泛存在于根系分泌物中，这些物质普遍对植物有化感效应，同时对土传性病原菌有一定的抑制作用（Xuan et al.，2006；周宝利 等，2010）。酚类物质则是较为常见的化感自毒物质。陈君良（2016）从百合的根系分泌物中检测到了邻苯二甲酸二丁酯、2，4-二叔丁基苯酚等具有化感活性的物质，并发现它们均对萝卜种子的萌发有抑制作用。段曦等（2017）通过GC-MS分析，发现嫁接辣椒根系分泌物中含有邻苯二甲酸二异辛酯，能够抑制根腐病菌和青枯病菌的增殖。因此，推测这些物质可能是对番茄青枯病菌产生抑制作用的关键活性物质，而其在植物体内相关的代谢途径与嫁接提高番茄抗青枯病的机理仍有待进一步研究。由于采用单一溶剂萃取会导致植物根系分泌物中的某些活性成分漏筛，可进一步选用不同极性的有机溶剂来进行提取和分析（祁之秋 等，2018）。对根系分泌物中的活性物质进行分离和分子结构分析，合成具有杀菌活性的新型植物源制剂，将有助于田间番茄青枯病的防控。