葫芦素E对人喉癌干细胞生理活动的影响及 分子机制探究

何佳怡 卫旭东 何健 王心怡 吕睿 马青

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,喉癌的发病率占耳鼻咽喉部位恶性肿瘤的 7.9%～35.0%［1］,近40%患者确诊时已为Ⅲ期或Ⅳ期。此时,采用外科手术治疗的方法效果有 限［2,3］。近年来,化疗在喉癌治疗中的地位日益提高。然而,耐药性的产生成为化疗失败的重要原因之一,已有研究认为,肿瘤细胞产生耐药性的机制中,三磷酸腺苷(ATP)结合盒(adenosine triphosphate-binding cassette,ABC)转运蛋白的过表达是重要原因之一,它能消耗能量将底物从细胞内泵 出［4］。P-gp和ABCG2属于ABC转运蛋白超家族中常见的两种蛋白,可将多种内源性和外源性化合物泵出细胞外,与肿瘤干细胞耐药性有密切关系［5,6］。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是肿瘤组织中存在的一部分具有干细胞性质的细胞,理论认为肿瘤细胞起源于CSC,并常具有耐药特性［7］。葫芦素E是一类提取自葫芦科植物的四环三萜类化合物,近年来有研究表明,葫芦素E具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用［8］。但对人喉癌肿瘤干细胞的耐药抑制及其潜在的分子机制尚不清楚,因此,本研究拟通过探究葫芦素E对喉癌干细胞增值、迁移、侵袭等生理活动的影响,并寻找相关的分子机制,探究葫芦素E对于喉癌干细胞耐药性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人喉癌细胞株Hep-2购买自中南大学湘雅医学院细胞库。胎牛血清(FBS)以及Matrigel购买于美国Gibco公司。Transwell 小室购自美国Costar公司,鼠抗人P-gp抗体及抗人ABCG2抗体购自美国Santa Cruz公司,葫芦素E以及FITC标记的CD133抗体购自美国Sigma公司。

1.2 细胞分选与培养 喉癌细胞株 Hep-2购自中南大学湘雅医学院细胞库。细胞培养于含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基中,于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养,细胞生长至80%的密度时进行传代。本实验通过流式细胞仪分选CD133+肿瘤干细胞,分选出的喉癌干细胞在前述相同条件下进行培养与传代。

1.3 CCK-8法检测葫芦素E对干细胞增殖能力的影响 采用CCK-8法检测葫芦素E对细胞增殖作用的影响。在96孔板中每孔种入10000个细胞,用不同浓度葫芦素E(0、2.5、25.0、50.0、70.0 μmol/L)培养,每个浓度设3复孔。作用12、24、36 h后,加入10 μl CCK8,37℃孵育2 h测吸光度。

1.4 Transwell实验检测葫芦素E对干细胞迁移和侵袭能力的影响 24孔板中加入0.1% BSA-RPMI 1640培养基600 μl,将Transwell小室置于24孔板中,用不同浓度葫芦素E培养。12 h后取出小室,用甲醛于室温固定0.5 h,结晶紫染色0.5 h。显微镜拍照,并计算穿过滤膜的细胞数,每膜计数5个随机不同视野,每组设3次重复。侵袭实验将Transwell小室滤膜内表面涂以Matrigel 5 μg形成人工重组基底膜,其余步骤与侵袭相同。

1.5 Western Blot检测葫芦素E对干细胞相关蛋白表达水平的影响 细胞生长至80%密度时,采用不同浓度葫芦素E培养细胞24 h后,使用RIPA提取蛋白。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品,用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,后用含脱脂奶粉的TBS-T室温封闭1 h,将一抗覆盖膜后孵育2 h,并加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h后,送至暗室中加入ECL试剂,并在ImageQuant 350电泳凝胶成像分体系统中曝光拍照,借助Image J软件对图像进行分析。

2 结果

2.1 葫芦素E对喉癌干细胞增殖的影响 实验中用不同浓度的葫芦素E处理干细胞后,采用CCK-8法检测葫芦素E对干细胞的增殖的抑制作用。结果表明,相较葫芦素E浓度为0 μmol/L时葫芦素E能够明显抑制干细胞体外增殖活性,随着葫芦素E浓度的增加而增强,细胞存活率下降。见图1。

图1 葫芦素E对喉癌干细胞增殖的影响

2.2 葫芦素E对喉癌干细胞迁移的影响 实验中用不同浓度的葫芦素E处理干细胞后,采用Transwell实验来检测葫芦素E对干细胞的迁移的抑制作用。结果表明,相较对照组,葫芦素E能够明显抑制干细胞迁移能力,并且该作用随着葫芦素E浓度的增加而增强。见图2。

图2 葫芦素E对喉癌干细胞迁移的影响

2.3 葫芦素E对喉癌干细胞侵袭的影响 实验中用不同浓度的葫芦素E处理干细胞后,采用Transwell实验来检测葫芦素E对干细胞的侵袭的抑制作用。结果表明,相较葫芦素E浓度为0 μmol/L时葫芦素E能够明显抑制干细胞侵袭能力,并且该作用随着葫芦素E浓度的增加而增强。见图3。

图3 葫芦素E对喉癌干细胞侵袭的影响

2.4 葫芦素E对耐药相关蛋白表达的影响 用不同浓度的葫芦素E处理喉癌干细胞后,提取细胞蛋白以通过Western Blot检测相关蛋白表达水平。结果表明,葫芦素E抑制了肿瘤耐药相关蛋白ABCG2以及P-gp蛋白的表达水平。见图4。

图4 葫芦素E对耐药相关蛋白表达的影响

3 讨论

通过实验结果发现,葫芦素E能使喉癌干细胞增殖、迁移以及侵袭能力受抑制、促进细胞凋亡,并能够降低喉癌细胞耐药性相关的ABCG2及P-gp蛋白的表达,该效应存在剂量-反应关系。

近年来研究显示,在肿瘤细胞中存在着少数具有异质性的亚群,其在形态、表型、增殖能力以及致瘤能力等方面存在很大差异,被认为具有肿瘤起始能力,故称之为肿瘤干细胞［9］。耐药性作为肿瘤干细胞的特性之一,多数耐药分子如 Br-cp1/ABCG2、MRP1/2 等通常在喉部、消化道、肝肾等组织中均有不同程度的表达,这些分子在维持机体的生理屏障如血脑屏障、血睾屏障、母体-胎儿屏障、胎盘和血脑脊髓液屏障处发挥极其重要的作用［10］。在肿瘤干细胞膜上的 ABC 转运体家族膜蛋白高表达,这些转运体蛋白可有效地将许多代谢产物、药物等物质排出,使得化疗药物对肿瘤干细胞的杀伤作用明显减弱。肿瘤干细胞多药耐药是肿瘤化疗的主要障碍,严重影响着患者的预后和生存率。

P-gp与ABCG2作为ABC 转运体家族膜蛋白的代表,在肿瘤细胞的耐药性形成中发挥着重要的作用。P-gp是发现较早并且研究较多的一种耐药蛋白,它由mdrl基因编码,是一种能量依赖性的跨膜转运蛋白。ABCG2则最初由乳腺癌细胞中提取,介导多药耐药机制。其共同特征在于能利用水解ATP释放的能量将摄入细胞内的药物排出,降低胞内药物浓度,减少药物对于癌细胞的损伤,从而参与癌细胞的耐药机制。

葫芦素E是广泛存在于葫芦科植物的一类四环三萜类化合物［11］,研究表明,葫芦素E药理作用广泛,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用。葫芦素E可直接破坏肿瘤细胞骨架［12］,产生细胞毒性并诱导细胞凋亡或死亡,还可通过下调细胞周期相关蛋白cyclin B1与cyclinA、CDK1以及CDC25C,发挥阻滞细胞周期的作用［18,19］。此外,还有研究发现,通过抑制转录因子STAT3的磷酸化,葫芦素E可对肿瘤细胞的迁移与侵袭起到抑制作用［13］。现有研究表明,葫芦素E对结肠癌、乳腺癌、喉癌等多种起源的肿瘤细胞造成明显抑制［14］。本研究结果发现,葫芦素E可以使喉癌干细胞的增殖、迁移、侵袭以及细胞周期受到抑制,促进细胞凋亡,该效应存在剂量-反应关系,这一结果支持了前述研究的观点。本研究结果还发现葫芦素E还能减低耐药相关基因的表达,下调耐药蛋白ABCG2及P-gp水平,从而减少耐药蛋白对于细胞毒性物质的外排,并最终起到逆转耐药的作用。通过抑制喉癌干细胞的生理活动,葫芦素E可抑制肿瘤组织的活性,并可通过逆转耐药作用,提高化疗药物的作用效果。

综上所述,葫芦素E能显著抑制人喉癌干细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡、下调蛋白ABCG2及P-gp的表达水平,葫芦素E对于喉癌干细胞的抑制作用,可能与其直接抑制细胞周期、促进细胞凋亡、影响细胞通路有关,也可能与其下调耐药相关蛋白表达,减低干细胞耐药性有关,这使葫芦素E有望成为对喉癌靶向治疗药物。而葫芦素E应用于临床的有效性以及安全性等,仍是有待进一步研究的问题。