五味子及其炮制品对肾精亏虚大鼠的治疗作用

赵芷含， 王馨雅， 王晓婷， 孙冬月， 高 慧

（辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600）

五味子是木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill. 的干燥成熟果实， 具有收敛固涩、 益气生津、 补肾宁心功效， 主治梦遗滑精、 遗尿尿频、 久嗽虚喘等症状[1］。 传统中医理论记载， 五味子“入嗽药生用， 入补药熟用”[2］， 即生熟异用， 但“入补药熟用” 指的是五味子哪种炮制品尚未见明确记载， 1963 年版《中国药典》中收录的是五味子和酒五味子， 而1977 年版及以后几版变更为五味子和醋五味子。 前期课题组进行药效实验， 在一定程度上证明了五味子生熟的差异， 认为治疗肾阳虚、 肾阴虚时应选酒五味子[3-4］； 本实验建立大鼠肾精亏虚模型，研究五味子及其炮制品对肾精亏虚大鼠附睾、 肾、 睾丸组织的影响， 为酒五味子“入补药熟用” 的传统理论提供现代药理学依据。

1 材料

1.1 试药 雷公藤多苷片（10 mg／片， 批号Z43020138，湖南千金协力药业有限公司）； 血清INH-B 试剂盒（批号BPE30393）、 血清FSH 试剂盒（批号BPE30597） （上海朗顿生物科技有限公司）。 五味子购于辽宁省丹东市五味子GAP 基地， 经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. 的干燥成熟果实。

1.2 仪器 数控超声波清洗器（KQ-250DB 型， 昆山市超声仪器有限公司）； 电子分析天平 （万分之一， Acculab型； 十万分之一， CP225D 型， 德国Sartorius 公司）； 移液器、 MultiskanMK3 酶标仪（美国Thermo 公司）； 卧式超低温保存箱（DW-86W100 型， 青岛海尔电器有限公司）； 生物显微镜（BX51 型）、 光学显微镜（BX60 型） （日本奥林巴斯公司）； 电热恒温水浴锅（DZKW-D-2 型， 北京永光明医疗仪器有限公司）； 病理组织包埋机； 组织切片机。

1.3 动物 SD 大鼠， 雄性， 体质量180～220 g， 由辽宁长生生物技术有限公司提供， 动物生产许可证号SCXK （辽）2010-0001， 室温（25 ℃）、 相对湿度50%条件下适应性饲养1 周。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 造模药物 将雷公藤多苷片研磨后， 加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 溶液， 超声溶解， 即得（3 g／L）。

2.1.2 酒五味子、 醋五味子 参照前期确定的炮制工艺自行制备[5］。

2.1.3 样品水煎液 取适量生、 酒、 醋五味子， 10 倍量水回流提取3 次， 每次1 h， 合并滤液并浓缩， 即得（280 g／L）。

2.2 造模与给药 连续灌胃雷公藤多苷水溶液（10 mg／kg） 30 d[3-4］以建立肾精亏虚大鼠模型， 大鼠皮毛体毛松懈、 少有光泽、 行为迟缓、 精神状态不佳、 畏寒聚堆、 体质量下降时可认为造模成功。 将大鼠随机分成模型组、 生五味子组、 酒五味子组、 醋五味子组， 另设空白对照组， 每组10 只， 给药组大鼠按2.8 g／kg 剂量灌胃给药，模型组、 空白组大鼠给予等体积生理盐水， 连续30 d， 最后1 次给药后30 min 处死大鼠， 取出肾脏、 睾丸、 附睾组织进行相关检测。

2.3 检测指标

2.3.1 附睾、 肾组织质量 取大鼠新鲜附睾、 肾组织， 精密称定质量。

2.3.2 睾丸组织病理学检查 取新鲜大鼠单侧睾丸组织，4%多聚甲醛溶液固定， 常规石蜡包埋， 苏木精-伊红染色后在光学显微镜下进行检查。

2.3.3 血清INH-B、 FSH 水平测定 按试剂盒说明书操作步骤进行测定。

2.3.4 生精细胞病理学检查 取大鼠单侧睾丸， Bouins 溶液固定， 酒精脱水， 石蜡包埋， HE 染色， 在光学显微镜下观察生精细胞凋亡， Cosentino 法对睾丸组织结构进行4 分制评分[正常睾丸组织， 生精上皮排列规则， 计为1 分；生精上皮排列不规则， 结构松散（彼此间无黏附）， 紧贴精细小管排列， 计为2 分； 生精上皮排列更加不规则， 而且有脱落、 缺失， 可见核固缩现象， 精细小管边界模糊不清， 计为3 分； 紧贴精细小管的生殖细胞出现明显凝固性坏死， 计为4 分］， Johnson 法[6］评估精子发生和障碍程度[生精功能正常， 计为10 分； 各阶段都存在生精细胞， 但其布列紊乱， 计为9 分； 生精小管中含精子量5 ～10 个，计为8 分； 无精子， 但有许多精子细胞， 计为7 分； 无精子， 仅有少量精子细胞（5 ～10 个）， 计为6 分； 无精子，但有许多精母细胞， 计为5 分； 无精子， 仅有少量精母细胞（＜5 个）， 计为4 分； 仅有精原细胞， 计为3 分； 没有生精细胞， 只有支持细胞， 计为2 分； 管腔内无细胞， 计为1 分］。

2.3.5 生精细胞凋亡率测定 采用原位末端标记法（TUNEL 法）， 严格按照试剂盒说明书操作步骤进行， 每张病理切片在光学显微镜下随机拨取10 个生精小管， 读取数量后， 计算生精细胞凋亡率。

2.4 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理， 数据以±s） 表示。 以P＜0.05 为具有显著性差异。

3 结果

3.1 五味子对大鼠附睾、 肾组织质量的影响 表1 显示，与模型组比较， 给药组大鼠附睾、 肾组织质量显著增加（P＜0.01）， 以酒五味子组更明显（P＜0.01）。

表1 五味子对大鼠附睾、 肾组织质量及INH-B、 FSH 水平的影响s， n=10）

表1 五味子对大鼠附睾、 肾组织质量及INH-B、 FSH 水平的影响s， n=10）

注：与模型组比较，∗∗P＜0.01；与生五味子组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

空白对照组 — 0.78±0.10∗∗ 0.46±0.05 0.80±0.01∗∗ 0.85±0.09∗∗模型组 — 0.62±0.02 0.28±0.02 0.36±0.03 0.37±0.02生五味子组 2.8 0.69±0.02∗∗ 0.34±0.01∗∗ 0.53±0.02∗∗ 0.44±0.02∗∗酒五味子组 2.8 0.76±0.09∗∗△△ 0.41±0.04∗∗△△ 0.76±0.01∗∗△△ 0.75±0.02∗∗△△醋五味子组 2.8 0.73±0.07∗∗△ 0.37±0.03∗∗△ 0.63±0.02∗∗△△ 0.64±0.03∗∗△△

3.2 五味子对大鼠INH-B、 FSH 水平的影响 表1 显示，与模型组比较， 给药组大鼠INH-B、 FSH 水平显著升高（P＜0.01）， 以酒五味子组更明显（P＜0.01）。

3.3 五味子对大鼠睾丸组织病理形态学的影响 图1 显示， 空白对照组大鼠睾丸生精小管呈卵圆形或圆形， 形态圆而规则， 含有大量生殖细胞， 精原细胞紧密黏附在精小管的基底膜上， 呈圆形或扁圆形， 生精细胞在不同时期排列整齐， 紧密， 有序， 层次分明； 模型组大鼠睾丸生精小管的生精上皮明显变薄， 细胞层次杂乱， 一些生精细胞脱落， 并出现轻微聚团现象， 管腔内充满各级生精细胞， 精母、 精原细胞数减少， 精子细胞、 精子减少量更明显， 细胞体积明显缩小， 睾丸间质细胞出现轻度肿大， 间质细胞减少， 出现较大空隙； 生五味子组大鼠睾丸生精小管呈近椭圆形或圆形， 生精小管含有大量精子， 生精细胞排布较疏松， 细胞层次减少； 酒、 醋五味子组大鼠睾丸生精小管呈卵圆形或圆形， 细胞排布紧密， 并与生精小管基底膜紧密连接， 生精细胞数略有减少， 部分区域可见脱落的小量生精细胞， 但结构清楚， 层次较分明。

图1 五味子对大鼠睾丸组织病理形态学的影响（HE 染色， ×200）

3.4 五味子对大鼠生精细胞的影响 图2 显示， 空白对照组大鼠生精细胞排列致密紧凑， 数量较多； 模型组大鼠生精细胞明显减少， 布列紊乱无序； 生、 酒、 醋五味子组大鼠生精细胞数目明显高于模型组， 数量多， 排列致密紧凑。

图2 五味子对大鼠生精细胞的影响（HE 染色， ×400）

3.5 五味子对大鼠Cosentino 评分、 Johnson 评分、 凋亡率的影响 表2 显示， 与模型组比较， 生五味子组大鼠仅Cosentino 评分显著降低（P＜0.01）， 而酒、 醋五味子组大鼠Cosentino 评分、 凋亡率显著降低（P＜0.01）， Johnson 评分显著升高（P＜0.01）， 以酒五味子组更明显（P＜0.01）。

表2 五味子对大鼠Cosentino 评分、 Johnson 评分、 凋亡率的影响s， n=10）

表2 五味子对大鼠Cosentino 评分、 Johnson 评分、 凋亡率的影响s， n=10）

注：与模型组比较，∗∗P＜0.01；与生五味子组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

空白对照组 — 1.01±0.01∗∗ 9.78±0.21∗∗ 10.51±4.09∗∗模型组 — 3.31±0.16 8.36±0.35 31.37±6.02生五味子组 2.8 2.00±0.07∗∗ 8.53±0.42 25.44±8.72酒五味子组 2.8 1.35±0.09∗∗△△ 9.56±0.81∗∗△△ 15.75±5.06∗∗△△醋五味子组 2.8 1.84±0.15∗∗△ 9.23±0.62∗∗△ 20.64±4.73∗∗△

4 讨论

抑制素B （INH-B） 参与精子发生， 对预测不育患者无精子症和精子获得率具有重要意义， 它主要由睾丸支持细胞合成， 是评估精子发生的直接有效内分泌指标[7］， 当睾丸生精功能受损时， 血清中其水平有所降低[8］； 卵泡刺激素（FSH） 也称为精子生成素[9］， 主要作用于睾丸支持细胞， 促进睾丸曲细精管精子生成[9］， 在支持细胞增殖、分化、 成熟、 分泌中起着关键作用， 当它与支持细胞膜上其受体结合后， 可使支持细胞内环腺嘌呤核苷酸（cAMP）水平升高， 从而促使其合成并分泌多种物质[10］， 可直接或者间接介入生精细胞的发育成熟， 促进睾丸曲精管生产精子。 另外， 精子本身在发生过程中就存在生精细胞凋亡现象， 机体可通过凋亡来维持精子数量动态平衡， 在一些特殊情况下可诱导生殖细胞凋亡增长[10-11］， 一旦生精细胞过度凋亡， 将会影响精子产生量， 导致各种生精阻滞。

雷公藤多苷等多种药物和化学毒物对支持细胞有生殖毒性作用， 可损害生精功能[11-14］。 本实验发现， 肾精亏虚模型大鼠附睾、 肾组织质量明显减少， 而给药后其质量明显增加， 其中酒、 醋五味子效果优于生五味子， 又以前者更强； 模型大鼠血清INH-B、 FSH 水平及生精功能明显下降， 而给药后可明显改善两者水平， 减少生精细胞脱落，从而提高大鼠生精功能， 其中酒、 醋五味子效果优于生五味子， 又以前者更强。

综上所述， 五味子炮制后能增强对肾精亏虚大鼠的治疗作用， 以酒五味子更明显， 故临床上“入补药熟用” 时宜选用该炮制品。