喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达变化及意义

车娟，张肖林，徐舒舒，袁进，曹瑞娟，温艳玲，赵洪春

(1滨州医学院附属医院，山东滨州256603；2胜利油田中心医院)

喉鳞状细胞癌(喉鳞癌)约占原发性喉恶性肿瘤的98%，是头颈部第二常见恶性肿瘤[1]。虽然现代医学诊断和治疗技术有了很大提高，但喉鳞癌浸润和转移仍是目前临床面临的难题之一，涉及多种细胞、细胞因子、趋化因子等共同作用。骨桥蛋白(OPN)属于小整合素结合配体N-连接糖蛋白，是一种分泌型糖基化磷蛋白，广泛存在于人体各种组织和体液中，能够通过抑制肿瘤细胞凋亡、促进血管生成及肿瘤细胞侵袭、维持干细胞表型等方式，参与肿瘤的恶性生物学行为。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知最重要的促血管生成因子，其与相应受体结合能促进肿瘤血管形成。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种可降解细胞外基质的内肽酶，在肿瘤侵袭、血管生成等过程中具有重要作用。有研究报道，在乳腺癌、肝癌、肺癌、喉癌等组织中OPN、VEGF、MMP-9表达异常，且其表达与肿瘤恶性程度、转移及患者预后密切相关[2～6]。但目前OPN、MMP-9、VEGF在喉鳞癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭、转移、患者预后的关系，国内鲜有报道。本研究观察喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达变化，并分析其表达与患者临床病理参数、预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年12月～2014年9月滨州医学院附属医院收治的初诊原发性喉鳞癌患者80例，均经术后病理检查明确诊断，术前未行任何抗肿瘤治疗。其中，男59例、女21例，年龄36～77岁(<60岁43例，≥60岁37例)；有吸烟史61例，有饮酒史58例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期52例，Ⅲ、Ⅳ期28例；组织分化程度：高分化42例，中分化24例，低分化14例；有淋巴结转移41例，无淋巴结转移39例;肿瘤解剖部位：声门型59例，非声门型21例。本研究经滨州医学院附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 喉鳞癌组织及癌旁正常组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达检测 采用免疫组化SP法。取手术切除的喉鳞癌组织80例份、癌旁正常组织(距肿瘤>5 mm，且经病理检查未见喉癌细胞浸润)30例份。常规制作石蜡切片，按超敏二步法免疫组化检测试剂盒说明进行免疫组化染色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。由2位病理科医师采用双盲法独立阅片。OPN阳性染色主要定位于细胞质或细胞膜，VEGF阳性染色主要定位于细胞质，MMP-9阳性染色主要定位于细胞质或细胞膜，均呈黄色或棕黄色。每张切片随机选取3～5个400倍视野，评估染色强度；每视野至少计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。染色强度评分：未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比评分：≤10%为0分，>10%～25%为1分；>25%～50%为2分；>50%～75%为3分，>75%为4分。两项评分乘积≥1即为目标蛋白阳性表达。

1.3 随访 选取2010年12月～2012年11月手术治疗的喉鳞癌患者52例，术后采用门诊复查或电话等方式定期随访，随访至2017年11月，共随访1～60个月。存活32例，死亡13例，拒绝继续随访或失访7例。将拒绝随访和失访者剔除，对45例喉鳞癌患者进行生存分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。相关性分析采用Spearman相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉鳞癌组织与癌旁正常组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达比较 喉鳞癌组织与癌旁正常组织中OPN蛋白阳性表达率分别为58.75%(47/80)、10.00%(3/30)，VEGF阳性表达率分别为77.50%(62/80)、13.33%(4/30)，MMP-9阳性表达率分别为63.75%(51/80)、6.67%(2/30)，两种组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达率比较，P均<0.05。

2.2 喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达的关系 Spearman相关分析结果显示，喉鳞癌组织中OPN蛋白阳性表达与VEGF、MMP-9蛋白阳性表达均呈正相关(rs分别为0.278、0.266，P均<0.05)，VEGF蛋白阳性表达与MMP-9蛋白阳性表达呈正相关(rs=0.279，P<0.05)。

2.3 喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达与患者临床病理参数的关系 喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达与肿瘤临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史及肿瘤解剖部位无关(P均>0.05)。见表1。

2.4 喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白表达与患者预后的关系 随访的45例喉鳞癌患者中，OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达者5年生存率分别为59.26%(16/27)、63.54%(21/34)、60.00%(18/30)，阴性表达者分别为88.89%(16/18)、100%(11/11)、93.33%(14/15)，OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达者5年生存率均低于阴性表达者(P均<0.05)。三种蛋白均阳性表达者5年生存率为47.37%(9/19)，其余为88.46%(23/26)，比较P<0.01。

表1 喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系(例)

3 讨论

喉癌是头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，占所有头颈部肿瘤的13.9%，以喉鳞癌最为常见[7]。喉鳞癌具有局部侵袭和颈部淋巴结转移等恶性生物学特征，是导致患者预后不良的主要因素之一。因此，探索喉鳞癌发病、侵袭及转移的分子生物学机制具有重要意义。

OPN属于小整合素结合配体N-连接糖蛋白，是一种分泌型糖基化磷蛋白，其受体家族包括整合素受体家族和CD44受体家族。有研究发现，OPN不仅能通过依赖特定剪切体(OPN-b、OPN-c)抑制肿瘤细胞凋亡，还能依赖其整合素受体α9β1、αvβ3诱导肿瘤生长和血管生成[8]，是参与调节肿瘤恶性生物学行为的关键因子之一。有研究还发现，肿瘤组织中OPN高表达预示患者较低的生存率和较高的复发率[9]。采用RNAi技术沉默OPN表达能明显抑制喉鳞癌细胞活性和侵袭能力[10]。因此，OPN有可能成为喉鳞癌的一个潜在治疗靶点。血管生成是肿瘤侵袭和转移过程中关键环节，VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子，其与相应受体结合可调控血管生成，在肿瘤新生血管形成中有重要作用。Schlüter等[11]报道，在喉鳞癌组织中VEGF高表达与患者总体预后不佳和复发增加有关。西妥昔单抗、贝伐单抗可靶向作用VEGF，与VEGF特异性结合，从而阻断血管生成，继而抑制肿瘤生长、侵袭和转移[12～14]。此外，OPN可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶(ERK)及核因子κB(NF-κB)信号通路，促进VEGF表达，刺激肿瘤血管生成[15]。这些新生血管为肿瘤组织提供了丰富的血液和营养物质，加速了肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。MMP-9是一种可降解细胞外基质的内肽酶，在细胞外基质的降解过程中发挥重要作用，可激发基质降解的瀑布式反应，使肿瘤细胞更加容易穿透基底膜，从而促进肿瘤浸润和转移[16]。OPN可通过相关信号通路激活NF-κB和信号转导与转录活化因子3，参与调节MMP-9、MMP-2表达。因此，OPN还可作为MMP-9的上游调节蛋白共同促进细胞外基质降解，从而促进肿瘤侵袭和迁移。但目前OPN、MMP-9、VEGF在喉鳞癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭、转移和患者预后的关系，国内鲜有报道。

本研究结果显示，喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白阳性表达率均明显高于癌旁正常组织；相关分析发现，喉鳞癌组织中OPN蛋白阳性表达与VEGF、MMP-9蛋白阳性表达呈正相关关系，VEGF蛋白阳性表达与MMP-9蛋白阳性表达亦呈正相关关系。提示OPN、VEGF、MMP-9可能协同促进喉鳞癌的发生发展。进一步研究发现，喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9表达与肿瘤临床分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，与患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史及肿瘤解剖部位无关，这表明喉鳞状细胞癌中OPN、VEGF、MMP-9蛋白的表达与肿瘤的浸润和转移有关。研究还发现，OPN、VEGF、MMP-9阳性表达者5年生存率均明显低于阴性表达者，且三者均阳性表达者5年生存率最低。提示OPN、VEGF、MMP-9蛋白高表达与喉鳞癌患者预后不良有关，有可能作为患者预后的预测指标。

综上所述，喉鳞癌组织中OPN、VEGF、MMP-9蛋白高表达，其高表达与肿瘤进展和患者预后不良有关。早期联合检测OPN、VEGF、MMP-9表达有助于筛选高危病例并进行针对性的个体化治疗，从而改善患者预后。