翠云草总黄酮对肺癌细胞生长的抑制作用

舒姮，毛知娟，杨勇，周燕，叶卉

翠云草（Selaginella uncinata (Desv.) spring）是卷柏科卷柏属植物，又名蓝地柏、绿绒草、金鸡凤尾草，主要在我国广东、广西、云南、贵州等南方地区分布。翠云草为民间习用药，植物全草均可药用，具有清热解毒、消瘀、止血、利湿等功效[1～2]。研究发现翠云草中的黄酮类物质丰富，主要含有穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔-4＇-甲醚和2″，3″-二氢-4-甲氨基穗花杉双黄酮等[3]。有研究发现翠云草的总黄酮（total flavones of Selaginella uncinata（Desv.）spring，TFS ）具有抑制结肠癌细胞的作用[4]。但翠云草的黄酮类物质对肺癌细胞的生长是否具有抑制效应未见报道。本研究通过TFS作用于肺癌A549细胞和H460细胞，观察其对肺癌细胞生长的影响和作用机理，为翠云草抗肿瘤活性的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

翠云草购于四川省荷花池中药材市场；A549细胞、H460细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）、DMEM高糖培养基（GIBCO公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、CCK8试剂盒与细胞周期检测试剂盒、ECL化学发光试剂（碧云天生物技术有限公司）；兔源ERK抗体、兔源

p-ERK抗体、兔源GAPDH抗体、羊抗兔多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；无水乙醇等分析纯试剂（成都科龙化工试剂）。酶标仪（FC，Thermo），流式细胞仪（CytoFLEX，Beckman），蛋白检测成像系统（Chemi Doc，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 翠云草总黄酮制备…取翠云草药材1000 g，粉碎成粗粉后过 60 目筛，用60%乙醇加热提取 20 min，提取 2 次，合并滤液，减压旋转蒸发后烘干至恒重， AB - 8 大孔吸附树脂纯化，70% 乙醇洗脱、富集，浓缩干燥得到翠云草提取物。以芦丁为对照品，提取物用甲醇溶解，酶标仪下进行扫描；提取物在 510 nm 有最大吸收峰，吸收光谱与芦丁相似，故翠云草提取物含有黄酮类物质。以芦丁作为标准品测定吸光度值绘制标准曲线， 根据回归方程计算出翠云草总黄酮的含量为 2.68 mg．g-1。翠云草总黄酮以DMSO溶解，配制成浓度为 1 mg．mL-1的溶液 4℃保存备用。

1.2.2 细胞培养及检测…A549细胞和H460细胞用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，青霉素100 IU．mL-1，链霉素IU．mL-1）于37 ℃、5% CO2常规培养。（1）细胞增殖检测：取处于对数生长期的细胞以每孔5千个的密度接种到96孔培养板中，24 h后加入终浓度为5～40 μg．mL-1的TFS，每个浓度6个重复孔，同时设置DMSO对照组；于加药后的24、48、72 h加入CCK8试剂，酶标仪450 nm处下测定吸光度值并计算生长抑制率。抑制率=（OD对照组-OD药物组）/OD对照组×100%。（2）细胞周期检测：取处于对数生长期的细胞以每孔10万个的密度接种到6孔培养板中，24 h后加入终浓度为10、20 μg．mL-1的TFS；加药24 h后消化离心收集细胞，根据细胞周期检测试剂盒的操作流程操作并于细胞流式仪检测分析细胞周期。（3）ERK蛋白和p-ERK蛋白检测：取处于对数生长期的细胞以每孔10万个的密度接种到6孔培养板中，24 h后加入终浓度为10 μg．mL-1和20 μg．mL-1的TFS；加药24 h后收集细胞，采用RAPI裂解液提取蛋白总蛋白，SDS-PAGE电泳，对蛋白进行电转移（200 mA，50 min）并切割目的条带，目的条带分别用ERK抗体、p-ERK抗体、GAPDH抗体4℃孵育过夜，羊抗兔多克隆抗体室温孵育2 h，加入ECL化学发光试剂后于蛋白检测成像系统检测目的蛋白。

1.2.3 数据统计分析…以三次重复实验的数据采用SPSS软件进行方差分析，以双尾α=0.05的水准进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 细胞增殖检测

TFS作用于肺癌A549细胞和H460细胞后，细胞的生长均受到抑制，抑制的效果随着TFS浓度的增加和作用时间的增长而增强。见图1。

图1 TFS对A549细胞和H460细胞生长的影响

2.2 细胞周期检测

TFS作用于肺癌A549细胞后，使细胞阻滞于G0/G1期；与对照组相比，两个TFS组的周期分布差异显著（P＜0.05）。作用于H460细胞后，使细胞阻滞于S期和G2/GM期；与对照组相比，两个TFS组的周期分布差异显著（P＜0.05）。与对照组相比，两种细胞中，DMSO对细胞的周期分布均无明显改变（P＞0.05）。在两种细胞中，TFS的剂量为10 μg．mL-1时与20 μg．mL-1时的细胞周期分布差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2和图3。

图2 TFS对A549细胞周期的影响

图3 TFS对H460细胞周期的影响

2.3 ERK蛋白和p-ERK蛋白检测

TFS作用于肺癌A549细胞和H460细胞后，降低了p-ERK的表达水平；此外，TFS还降低了H460细胞中ERK总蛋白的表达（P＜0.05），但对A549细胞中ERK总蛋白的表达影响不显著（P＞0.05）。在两种细胞中，TFS的剂量为10 μg．mL-1时与20 μg．mL-1时对总ERK蛋白和p-ERK蛋白的改变无显著差异（P＞0.05）。

图4 TFS对ERK蛋白表达的影响

3 讨论

恶性肿瘤在我国是致死性位居第二的疾病，其中肺癌的发病率和死亡率也在逐渐增加，已成为我国发病率最高的恶性肿瘤，每年约有700万人诊断为肺癌，600万人死于肺癌[5]。化学药物治疗是肺癌的主要治疗手段之一，但目前已在临床治疗中的药物在治疗过程中会出现药物耐受而降低治疗效果；开发新的药物是解决该问题的方法之一。我国药物资源丰富，从中草药中挖掘开发治疗肿瘤的药物不仅有助于肿瘤的临床治疗，也有助于夯实中药在现代临床治疗中的作用。

翠云草为卷柏科卷柏属植物，在南方广泛分布，具有清热解毒、利湿通络、化痰止咳、止血生肌等功效，内服和外用均可，在一些少数民族地区也有用于治疗肿瘤的临床应用。翠云草的主要活性物质为黄酮类化合物[6～8]，但对其黄酮类物质抗肿瘤活性的研究报道极少，仅有孙桢桢等人[4]的研究发现翠云草的总黄酮可能通过降低结肠癌HT-29细胞中环氧化酶COX-2的mRNA和蛋白的表达而发挥其抗肿瘤的效应。而明确翠云草黄酮类物质抗肿瘤的机制有助于翠云草活性物质在临床中的开发利用。

恶性肿瘤细胞最基本的生物学特征是失控性增殖；细胞失控性增殖的生物学基础是细胞周期调控紊乱，这种紊乱通常与肿瘤细胞内的重要信号通路调控失常有关；在多种肿瘤细胞中均发现有调控细胞生长增殖的信号异常活化。作为丝裂原活化蛋白激（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的主要信号通路之一的 Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是调控细胞生长、分化、凋亡等的主要信号通路之一，胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是该通路中的末端信号传递者，被上游的MEK磷酸化而激活后调节其他激酶或转录因子的活化进而调节多种基因的表达。研究发现ERK的高表达在非小细胞肺癌的发生、发展中起了重要的促进作用[9]；ERK通路在肺腺癌形成早期阶段已被激活，使癌细胞的增殖、侵袭、迁移等能力增强[10]；在肺癌患者的癌细胞中p-ERK的阳性表达率可高达70%[11～12]；抑制ERK通路的活性可能抑制肿瘤细胞生长，ERK信号通路已成为肿瘤治疗的重要靶点。

本研究发现，翠云草总黄酮对肺癌A549细胞和H460细胞的生长具有抑制作用，对两种细胞的周期进程均具有干扰，使A549细胞阻滞于G0/G1期和H460细胞阻滞于S期和G2/GM期；细胞周期进程的变缓或停滞则使细胞的生长增殖变缓。此外，翠云草总黄酮使A549细胞中ERK的活化水平降低，即p-ERK的表达降低；而使H460细胞中ERK总蛋白的表达和其活化水平均降低。以上结果表明，翠云草总黄酮对肺癌A549细胞和H460细胞的生长具有抑制作用，使细胞的周期进程停滞变缓，这种抑制作用可能与其降低ERK 信号通路的活性有关。而何种因子参与了该信号的上游调控以及何种下游基因发挥了抑癌效应则需要进一步的研究验证。本研究提示翠云草具有抑制肺癌细胞生长的潜能。