临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌分型及其耐药表型检测的研究*

范厚臻，孙运芳

(1.山东省临沂市中医医院检验科 276003;2.山东医学高等专科学校检验系，山东临沂 276000)

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是引起医院感染的主要病菌，已成为仅次于大肠埃希菌后第二致病菌，根据致病性不同常分为普通肺炎克雷伯菌(classic klebsiella pneumoniae)与高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent klebsiella pneumoniae)[1]。与普通肺炎克雷伯菌比较，高毒力肺炎克雷伯菌表现为可感染无基础疾病人群、首要症状为原发性肝脓肿、培养菌落为高黏性等特点[2-3]。调查研究发现，高毒力肺炎克雷伯菌多表现为K1、K1荚膜血清型，这两种荚膜血清型也是社区获得性感染的关键毒力因子[4]。耐药肺炎克雷伯菌感染是抗感染治疗中面临的最严重问题，有学者报道高毒力肺炎克雷伯菌感染超广谱β内酰胺酶(ESBLs)菌株检出率为20.7%～65.2%[5]。自我国台湾学者报道高毒力肺炎克雷伯菌以来，目前所报道病例多集中于亚洲地区与亚裔居民[6]。高毒力肺炎克雷伯菌感染是否具有地域或体质易感性，目前学者研究较少。本文以此为背景，回顾性分析临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌感染患者临床资料，探讨高毒力克雷伯菌分型、耐药表型与感染的关系。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2015年1月至2017年9月临沂市中医医院住院患者分离肺炎克雷伯菌98株及病历资料，所有患者均出现肺炎克雷伯菌感染且细菌培养成阳性，排除合并其他病原菌感染者。

1.2主要仪器与试剂 全自动微生物鉴定仪：法国生物梅里埃公司Vitek 2 Compact；聚合酶链反应(PCR)扩增仪：美国Bio-Rad公司PTC-200；电泳仪：美国Bio-Rad公司DYY-6D；凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司；PCR试剂与DNA marker Ⅰ：大连TaKaRa生物公司。

1.3检测方法

1.3.1菌株分离培养 98株肺炎克雷伯菌直接接种于血琼脂平板上，37℃培养24 h，挑单一菌落进行分纯孵育，采用全自动微生物鉴定仪重新鉴定菌株，PCR扩增测序确认。

1.3.2高黏液表型检测 采用拉丝试验方法，使用接种环挑取血琼脂平板上新鲜菌落进行牵拉，重复2次。黏液丝形成且长度大于或等于5 mm则判断为高黏液表型阳性，黏液丝形成且长度小于5 mm判断为阴性[7]。

1.3.3药敏试验 采用纸片扩散法对9种抗生素进行药敏试验，选择肺炎克雷伯菌ATCC700603、大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株，参照美国临床和实验室化协会(CLSI)2013年版评估药敏结果[8]。

1.3.4肺炎克雷伯菌血清型检测 参照WEI等[9]文献资料，采用多重PCR检测K1、K2、K5、K20、K54、K57等6种高毒力血清型基因。

1.3.5肺炎克雷伯菌株毒力基因检测 参照黎斌斌等[10]文献资料，采用PCR检测普通肺炎克雷菌、高毒力肺炎克雷伯菌毒力rmpA基因携带情况。

1.3.6高毒力肺炎克雷伯菌菌株确认 参照黎斌斌等[10]文献资料，将拉丝试验与rmpA基因均为阳性的黏液型菌株认定为高毒力株。

1.3.7多位点序列分析(MLST) 参照黎斌斌等[10]文献资料，对管家基因扩增测序分析，根据多位点序列分析数据确定等位基因与ST型。

2 结 果

2.1高毒力肺炎克雷伯菌菌株检出情况 98株肺炎克雷伯菌中，拉丝试验检出高毒力肺炎克雷伯菌33株(33.67%)。

表1 肺炎克雷伯菌感染临床特征分析

2.2临床特征 98例肺炎克雷伯菌感染患者中，男74例，女24例；年龄45～78岁，平均(61.33±7.35)岁；感染获得途径：医院获得性感染57例，社区获得性感染41例；感染部位：呼吸道74例，腹腔消化道6例，皮肤切口5例，尿液8例，其他5例；预后情况：治愈7例，好转75例，无效10例，死亡8例。高毒力肺炎克雷伯菌感染与普通肺克雷伯菌感染性别、年龄、感染部位、预后等比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌感染社区获得性感染率(63.64%)明显高于普通肺炎克雷伯菌感染(30.77%)，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.3分子特征 98例肺炎克雷伯菌感染菌株中，血清型：K1型16株，K2型9株，K5型5株，K20型4株，K57型64株；rmpA基因：阳性41株，阴性57株；MLST分型：ST23型22株，ST15型7株，ST11型5株，ST65型5株，其他59株。高毒力肺炎克雷伯菌K1与K2型占比60.61%(20/33)明显高于普通肺炎克雷伯菌菌株7.69%(5/65)，差异有统计学意义(χ2=35.000,P<0.01)；rmpA基因阳性率100.00%(33/33)明显高于普通肺炎伯雷菌菌株(12.31%，8/65)，差异有统计学意义(χ2=37.000,P<0.01)；ST23型51.52%(17/33)明显高于普通肺炎伯雷菌菌株7.69%，差异有统计学意义(χ2=22.000,P<0.01)。见表2。

表2 肺炎克雷伯菌感染分子特征分析(n)

2.4抗生素敏感性试验 高毒力肺炎克雷伯菌、普通肺炎克雷伯菌对美罗培南敏感性比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高毒力肺炎克雷伯菌对环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢曲松、头孢唑林、氨曲南、哌拉西林、复方磺胺甲噁唑敏感率均明显高于普通肺炎克雷伯菌，超广谱β内酰胺酶检出率低于普通肺炎克雷伯菌(P<0.05)。见表3。

表3 肺炎克雷伯菌对常用抗生素阳性率分析[n(%)]

3 讨 论

既往研究高毒力肺炎克雷伯菌主要集中在亚洲或亚裔人群，这是否意味着有地域易感性或体质易感性。临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌感染患者临床特征与我国其他地区是否存在差异，作者前期研究中并未进行分析[11]。本文研究中98例肺炎克雷伯菌感染血症患者中，检出高毒力肺炎克雷伯菌感染33例，普通肺炎克雷伯菌感染65例，两者在性别、年龄、感染部位等比较无统计学差异，高毒力肺炎克雷伯菌感染社区获得性感染率明显高于普通肺炎克雷伯菌。与黎斌斌等[10]报道的北京朝阳医院、魏丹丹等[12]报道的南昌大学第一附属医院基本相似，说明临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌感染患者临床特征与我国其他地区并没有本质上的差异；同时说明高毒力肺炎克雷伯菌感染菌株与社区获得性肝脓肿明显相关，而且部分患者并没有任何基础疾病。

高毒力肺炎克雷伯菌感染具有高侵袭性、高致死率以及潜在严重后遗症的特点，严重威胁人类生命健康[13]。分析高毒力肺炎克雷伯菌株分子特征对于患者诊断治疗尤为重要。肺炎克雷伯菌菌体表面荚膜是肺炎克雷伯菌主要毒力因子之一，能够诱导菌体拮抗宿主免疫杀伤作用[14]。根据荚膜多糖结构与抗原性的差异，目前至少可以分为78个荚膜血清型。相关研究表明，K1、K2、K5、K20、K54、K57等6种血清型与高毒力肺炎克雷菌明显相关，也是诱导各种侵袭性感染的主要血清型菌株[15-16]。本研究中，K1、K2是高毒性力肺炎克雷伯菌感染的主要血清型，占比达60.61%(20/33)，未检出K54血清型，与魏丹丹等[17]报道类似。可能与K1、K2型肺炎克雷伯菌荚膜合成能力较强、可拮抗吞噬细胞吞噬作用等因素有关。多位点序列分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌感染主要表现为ST23型(51.52%，17/33)，这也是社区获得性肝脓肿的主要肺炎克雷伯菌血清型，与苏桂新等[18]文献报道基本相似。

抗生素检出分析表明，高毒力肺炎克雷伯菌对环丙沙星、左氧氟沙星等8种抗生素阳性率均高于普通肺炎克雷伯菌，ESBLs阳性率明显低于普通肺炎克雷伯菌，说明高毒力肺炎克雷伯菌对ESBLs耐药性明显低于普通肺炎克雷伯菌，同时出现多重耐药性，给临床抗感染治疗造成困难。

本文研究结果表明，临沂地区高毒力肺炎克雷伯菌多为社区获得性感染，荚膜血清以K1与K2型为主，绝大多数携带rmpA毒力基因，ST23为主要流行菌株，对常用抗生素高度敏感，同时检出ESBLs阳性菌株与碳氢霉烯类耐药菌株。临床医生应分析高毒力肺炎克雷伯菌感染临床特征、分子特征及抗生素耐药性情况，给予早期诊断与治疗。