转录因子CP2在结直肠癌中的表达及临床意义*

陈 丽，付 丹，陈 霞

(四川省成都市第六人民医院消化内科 610051)

据国家癌症中心全国最新癌症报告显示，我国恶性肿瘤的发病率为278.07/10万，病死率为167.89/10万。其中，结直肠癌发病率已跃居恶性肿瘤第3位。截止2010年，我国结直肠癌新发病例数已超过27万，死亡病例13万以上,且有逐年增加的趋势[1]。这主要与结直肠癌晚期的侵袭转移密切相关。然而，目前对结直肠癌侵袭转移的研究仍未找到可靠、敏感的判断指标和治疗靶点。

转录因子CP2(transcription factor CP2，TFCP2)最初被认为其与小鼠a球蛋白基因的启动子区域相结合，通过增加TFCP2的表达后，激活a球蛋白的表达，可在体外诱导鼠白血病(MEL)细胞的分化[2]。近年来，TFCP2与肿瘤之间的关系得到越来越多研究者的报道。该转录因子在不同的肿瘤研究中发现其扮演了不一样的角色功能。有研究表明，TFCP2通过β-catenin/TCF 信号通路的激活，发挥癌基因的作用，可增加前列腺癌的侵袭转移等恶性生物学行为[3]。而在恶性黑色素瘤的研究中发现，TFCP2扮演的是抑癌基因的功能，TFCP2的高表达可以抑制黑色素瘤细胞的生长[4]。此外，TFCP2还参与了肿瘤细胞上皮间质转换，诱导肿瘤血管生成。与各种癌症发生发展等密切相关，如肝癌、胰腺癌、透明细胞肾细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌等[2]。然而，TFCP2在结直肠癌中的表达情况及与结直肠癌的临床病理参数之间是否存在一定的相关性，目前尚不清楚。本研究通过免疫组织化学、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法，在结直肠癌及癌旁结直肠黏膜组织中，对该基因做进一步深入研究。以期对临床结直肠癌的风险评估和预后判断提供有力的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 临床病理材料收集来自本院2011-2017年临床结直肠癌手术送检标本，共128例。患者年龄33～82岁，中位年龄56岁，其中淋巴结转移86例，无淋巴结转移42例。癌旁结直肠黏膜组织均取自距肿瘤原发灶大于5 cm的切除肠管。Western blot、 RT-PCR检测所采用的组织标本，均来自本院2017年结直肠癌手术切除的新鲜标本。本课题所有研究方法中的配对标本，采用的是同一患者手术切除的结直肠癌和其相对应的癌旁结直肠黏膜组织。

1.2方法

1.2.1主要试剂 一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗体购自美国Thermo Fisher公司，β-Tubulin抗体购自美国Santa Cruz公司。免疫组织化学染色SP检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及RT-PCR SYBR GreenⅠ检测试剂盒购自日本TaKaRa公司。蛋白提取试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.2苏木素-伊红(HE)及免疫组织化学染色 用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋切片，常规HE染色，证实为结直肠癌的病理诊断。其后，采用免疫组织化学SP法染色，比较结直肠癌和癌旁结直肠黏膜组织中TFCP2的表达。主要步骤参考试剂盒说明书进行：脱蜡，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复，过氧化氢作用;正常山羊血清封闭；一抗TFCP2兔抗人IgG多克隆抗体1∶200，4 ℃过夜;辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，37 ℃作用1 h；辣根过氧化物酶作用30 min；DAB显色，出现棕黄色着色后自来水冲洗终止反应；苏木素复染细胞核。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，作为阴性对照。

1.2.3RT-PCR 提取结直肠癌和癌旁结直肠组织RNA(按照TaKaRa试剂说明进行)。测定标本浓度，PCR反应(TaKaRa逆转录试剂盒)10 μL体系按说明书进行,TFCP2引物序列按照参考文献[4]设计，具体引物序列为：正向5′-TGG CTT CAA CAG TTC CCA TA-3′，反向5′-TCT GGC TGG TGG TTT GGT-3′。内参GAPDH引物序列为:正向5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC-3′，反向5′-ATG GAC TGT GGT CAT GAG TCC-3′。

1.2.4Western blot 配制10%分离胶，5%浓缩胶。依次加入Marker 5 μL(加拿大Fermentas公司)，待测样品20 μL。半干法转膜：采用聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Milliore公司)。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)漂洗印迹膜2次，放入5%蛋白封闭液(武汉博士徳)，室温封闭4 h。一抗孵育：TFCP2按1∶1 000稀释，内参Tubulin按1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜；二抗孵育，室温作用2 h。ECL显色：避光，在凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)中观察、拍照。

1.3免疫组织化学染色结果判断 显微镜下观察每例标本免疫组织化学染色表达情况：TFCP2表达位于细胞核内，阳性染色为浅棕色至棕褐色。根据参考文献[5]方法评估染色结果，采用染色百分比评分与染色强度评分相结合方法。染色百分比评分：没有阳性信号为0分，1%～10%细胞着色计为1分，11%～50%的细胞着色计为2分，51%～80%细胞着色计为3分，大于80%细胞着色计为4分。染色强度评分标准：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分。最后将染色阳性百分比得分与染色强度得分结果相乘，总分为0～12分，总分小于或等于6分设为阴性，大于6分设为阳性。病理阅片由2位有经验的病理医师双盲评分。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件系统进行统计学分析，比较结直肠癌与癌旁结直肠黏膜组织间以及肿瘤不同临床病理参数间TFCP2表达阳性率差异采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TFCP2的表达 免疫组织化学染色显示结直肠癌组织及癌旁结直肠黏膜组织中TFCP2的表达情况，TFCP2蛋白主要位于细胞核内，在不同TNM分期的结直肠癌中其表达具有异质性，见图1。TFCP2的表达在低分化的结直肠癌组织的表达强于高、中分化的结直肠癌组织。统计结果显示，128例的结直肠癌及癌旁结直肠黏膜组织中TFCP2的阳性表达率分别为86%和21%。

A：癌旁结直肠黏膜组织；B：高、中分化结直肠癌组织；C：低分化结直肠癌组织

图1TFCP2在癌旁结直肠黏膜及癌组织中的表达(免疫组织化学×200)

2.2RT-PCR结果 5例配对标本中，结直肠癌组织TFCP2 mRNA的表达水平显著高于癌旁结直肠黏膜组织，前者是后者的1.40～17.00倍。见图2。

2.3Western blot结果 TFCP2在结直肠癌组织的表达量是对应癌旁结直肠黏膜组织中的1.01～3.56倍。见图3。

2.4TFCP2的表达与结直肠癌临床病理特征的相关性 128例的结直肠癌标本按照临床病理特征分组，TFCP2的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤大小等无显著相关性，与浸润深度、分化程度、Dukes′分期和淋巴结转移等具有显著相关性(表1)。结直肠癌组织中TFCP2的表达为阴性和阳性分别为18/128(14.1%)和110/128(85.9%)，而癌旁结直肠黏膜组织中TFCP2的阴性表达和阳性表达分别为101/128(78.9%)和27/128(21.1%)，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 结直肠癌及癌旁结直肠黏膜组织中TFCP2 mRNA的表达水平

图3 TFCP2在结直肠癌肿瘤标本及癌旁结直肠黏膜组织中的蛋白表达水平

3 讨 论

TFCP2的DNA结合域有一个特点，它类似免疫蛋白的结构，与肿瘤抑制基因TP53相类似，因此其被认为很可能是p53基因的前体[6]。TFCP2也被认为可能扮演了抑癌基因的功能。然而，随着研究者不断地研究发现，TFCP2在不同肿瘤发生、发展中可能发挥了不同作用。一方面发挥了促癌的作用，例如，在对肝细胞性肝癌的研究中发现，在超过90%的肝细胞性肝癌标本，相对于正常肝组织，TFCP2是呈高表达的，它的表达水平与肝细胞性肝癌的进展密切相关[7]。在对口腔鳞状细胞癌的研究中发现，TFCP2在肿瘤细胞的表达是显著增强的，它与肿瘤TNM分期相关[8]。在对宫颈癌、卵巢癌的研究中发现TFCP2的表达和肿瘤的进展密切相关[9-10]。β-catenin/TCF信号通路在疾病的发生、发展过程中发挥了极其重要的作用[11]。有研究者在对胰腺癌的研究中发现，TFCP2可以激活β-catenin/TCF信号通路，从而促进了胰腺癌的侵袭转移[3]。然而β-catenin/TCF这条通路同样在结直肠癌的侵袭、转移中发挥了关键的作用[12]。因此，TFCP2在结直肠癌的侵袭、转移中是否发挥此作用还有待进一步研究。另一方面，有研究者在对恶性黑色素瘤的研究中发现，TFCP2在恶性黑素瘤肿瘤发生、发展过程中发挥了抑癌基因的功能。TFCP2的过度表达抑制了恶性黑色素瘤细胞的生长。TFCP2与死亡相关的蛋白激酶(DAPK)基因启动子区结合，正向调节其转录。DAPK在许多肿瘤中被证实其发挥的是抑制肿瘤细胞功能。因此，有研究表明，在某些情况下TFCP2可以起到抑制肿瘤的作用[4]。

然而，本研究结果表明，TFCP2的表达与肿瘤患者发生的年龄、性别肿瘤的部位及大小无关，与肿瘤的分化、浸润深度、侵袭转移、Dukes′分期等密切相关。通过RT-PCR及Western blot进一步证实TFCP2在结直肠癌组织的表达是显著高于癌旁结直肠组织，说明其高表达可能参与了肿瘤的发生和进展。但其与患者预后之间的关系，尚有待以后的随访资料来加以明确。结直肠癌发生的具体原因及机制尚未阐明，目前，研究者们更接受FEARON等[13]的大肠癌发生的经典模式，该模式认为肿瘤的发生可能是个复杂的过程，涉及多基因改变从而导致结直肠癌的发生，包括腺瘤性结肠息肉(APC)病基因，微卫星不稳定，p53基因的突变与缺失等。TFCP2基因曾被认为是TP53的前体基因，TFCP2基因与TP53基因在结直肠癌中的发生过程中是否有着内在的联系，尚有待进一步研究。本研究结果表明，TFCP2在结直肠癌组织中高表达，并且在淋巴结转移的病理标本中显著高表达，这提示TFCP2可能在结直肠癌的发展演进过程中发挥重要的作用，可能扮演了促癌的角色。其具体机制有待于进一步的研究证实。

综上所述，TFCP2的表达与结直肠癌分化、Dukes′分期以及侵袭转移存在显著相关性，在肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要的促癌作用。在临床标本中常规检测TFCP2的表达对于疾病的转移风险评估和预后判断有重要的提示作用。同时，通过对TFCP2的分子调控机制研究，可能对结直肠癌有重要的科研和临床指导价值。