马齿苋提取液对急性湿疹大鼠皮肤屏障功能的调控作用*

胡一梅，葛一漫，雍江堰，王 毅

(1.成都中医药大学临床医学院，成都 610037;2.成都中医药大学附属医院，成都 610075；3.成都中医药大学医学技术学院，成都 610037)

急性湿疹是临床上常见的炎性皮肤疾病，该病发病机制复杂，目前与皮肤屏障功能障碍相关的研究为主要方向之一[1-2]。皮肤屏障发挥正常的防御功能，以及保持表皮水分和电解质作用需要依靠角质层的完整，即“砖-墙结构”的完整。角质细胞作为“砖头”构成支架结构，细胞间脂质作为“泥浆”用来黏合稳固“砖头”。以上任一结构发生变化可能导致皮肤屏障异常，从而诱发急性湿疹。

本实验拟通过运用马齿苋提取液对急性湿疹大鼠模型进行干预治疗，结合局部皮损处经皮水分丢失量(transepidermal water loss，TEWL)、蛋白酶激活受体2(protease activated receptor-2，PAR-2)及人类中间丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)的表达，探讨马齿苋对皮肤屏障的调控作用及其在急性湿疹发生发展中起到的主要作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 体质量180～220 g的清洁级大鼠[成都达硕生物科技有限公司，许可证号:SCXK(111)2008-24]30只，雌雄不限。

1.1.2药物与试剂 马齿苋提取液(去根的新鲜马齿苋鲜榨提取获得)。二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene，DNCB；成都科龙化工试剂厂，批号：20090813)。

1.1.3仪器 AF200皮肤表皮水分丧失测定仪( 英国BIOX公司)；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增仪(美国ThermoFisher仪器有限公司)；Image-Pro Plus6.0病理图像分析系统(福建省麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组及造模 实验第1天首次致敏于大鼠腹部皮肤涂抹5% DNCB 30 μL，2 d后进行2次激发，在大鼠右背部皮肤涂抹0.2% DNCB 50 μL，连续攻击3次，每3天1次。第9天将20只造模大鼠平均分为模型组和马齿苋组。另有不作处理的10只大鼠为正常组。第10天马齿苋组大鼠给予马齿苋药物进行治疗，连续9 d。

1.2.2实验取材 末次给药后，断颈处死大鼠，取大鼠皮损组织2块，一块固定于10%中性甲醛中48 h；另一块置于-80 ℃液氮中速冻，待测。

1.2.3观察指标 (1)表皮TEWL值测定：采用皮肤表皮水分丧失测定仪测定各组大鼠TEWL值。(2)各组大鼠皮肤PAR-2及其水平的测定：将上述各组大鼠右背部皮肤包埋的蜡块切成4 μm厚的组织切片，按照免疫组织化学试剂盒说明书进行PAR-2免疫组织化学染色，同时设置阳性和阴性对照。一抗PAR-2购自北京博奥森生物技术有限公司，克隆号：bs-1178R。二抗及相应试剂盒及阳性片购自北京中山金桥生物有限公司。染色后封片，显微镜下观察，图像分析系统计算PAR-2的积分光密度。(3)RT-PCR检测大鼠皮肤FLG基因的表达：用Trizol法提取急性湿疹大鼠皮肤组织中的总RNA，并鉴定检测样品纯度。根据RT-PCR试剂盒说明书进行操作，使用System SDS Software软件计算循环阈值(Cycle threshold，Ct)，采用β-actin作为内参照基因，以2-△△Ct作为Filaggrin基因的表达水平。Filaggrin引物序列，上游5′-AGG AGC GAG ACC ATC AGC-3′；下游5′-GCA CCT TGC CAC TCT GTT-3′。β-actin引物序列，上游5′-TCT AGG CAC GTG GCA AGG GTG TG-3′；下游5′-TCA TGA GGT AGT TGC CGT CAG G-3′。

2 结 果

2.1各组大鼠大体外观比较 正常组大鼠皮肤光滑无异常，模型组大鼠右背部造模区皮肤出现肉眼可见红肿、丘疹、水疱、糜烂和渗出等急性湿疹症状。马齿苋组大鼠用药后，造模区皮肤红肿、糜烂和渗出等皮损程度降低，丘疹和水疱消散，皮肤变得光滑。见图1。

图1 各组大鼠皮肤临床表现

2.2各组TEWL的检测结果 用药后，正常组大鼠TEWL水平为(2.35±0.18)g·h-1·m-2，模型组为(11.36±1.66)g·h-1·m-2，马齿苋组为(3.25±0.47)g·h-1·m-2，与模型组比，马齿苋组大鼠TEWL水平显著降低(P<0.05)，但高于正常组(P<0.05)。

2.3各组大鼠皮肤组织PAR-2检测结果 镜下可见PAR-2阳性物质呈棕黄色、黄色、浅黄色颗粒状，位于皮肤表皮棘细胞、皮肤附属器汗腺细胞、皮脂腺细胞、毛囊细胞、真皮内炎细胞胞浆，部分位于真皮内间质组织中。用药后，马齿苋组PAR-2阳性物质染色变浅、分布面积减少(图2)。用药后，正常组大鼠PAR-2水平为(0.153 4±0.002 2)μm2，模型组为(0.170 8±0.011 5)μm2，马齿苋组为(0.154 1±0.006 8)μm2，与模型组相比，马齿苋组PAR-2水平明显降低(P<0.05)，但略高于正常组(P>0.05)。

2.4各组大鼠皮肤FLG的检测结果 正常组大鼠FLG基因表达为(6.20±0.68)，模型组为(0.79±0.19)，马齿苋组为(4.34±1.21)。与模型组比，马齿苋组大鼠FLG基因的表达显著增高(P<0.05)，但低于正常组(P<0.05)。

图2 各组大鼠皮肤组织中PAR-2的表达(免疫组织化学染色×200)

3 讨 论

外界过敏性物质对皮肤屏障的破坏是急性湿疹疾病发生、发展的诱因之一。由于皮肤屏障功能的异常表达，使过敏原从外环境渗透到皮肤，导致急性湿疹发生并进一步恶化[3]。马齿苋主要含有生物碱类、萜类、香豆素类、黄酮类、有机酸类、挥发油及多糖等化学成分，具有抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力的作用，在临床上主要用于治疗湿疹、炎症、瘙痒症和糖尿病等疾病[4]。作者的前期研究发现，马齿苋能够明显改善DNCB所致的大鼠急性湿疹症状[5-6]。

研究发现，皮肤屏障功能的优劣与代表角质层水分流失量的TEWL呈负相关关系，TEWL越高，表示角质层含水量越少，皮肤屏障功能损伤越严重[7]。本实验结果发现，急性湿疹大鼠TEWL明显增高，这与SIMPSON等[8]研究结果一致，马齿苋组TEWL比模型组显著降低。结果提示，马齿苋可能是通过减少TEWL，增加角质层水分含量，修复受损的皮肤屏障，达到治疗急性湿疹的作用。

急性湿疹发生时，皮肤代谢功能异常，使得皮肤抗炎因子和脂质减少，皮肤出现炎性反应，皮肤表面pH值升高，增加了激肽释放酶(kallikrein，KLKs)的活性，KLKs可进一步激活PAR-2，活化的PAR-2可使板层小体掩埋在角质细胞内难以释放，抑制其正常分泌，引起细胞间脂质水平的减少，破坏皮肤屏障功能[9-10]。激活的PAR-2还可引起炎性因子的过表达，加重皮肤组织的炎症损伤程度，进一步破坏皮肤屏障，形成恶性循环[11]。本实验结果发现，马齿苋组PAR-2水平比模型组显著降低。提示，马齿苋可通过降低PAR-2水平，减少TWEL，恢复皮肤屏障中“泥浆”的功能，缓解急性湿疹症状。

皮肤屏障的完整性是预防和治疗急性湿疹的前提，皮肤屏障形成的主要物质之一是FLG。若FLG基因发生无义突变，可导致丝聚合蛋白原失去活性，减少FLG的产生，破坏角质细胞“砖块”结构的支架作用[12]。本实验结果发现，急性湿疹大鼠FLG基因呈低表达，这与RIETHMULLER等[13]研究结果一致，马齿苋组FLG基因表达比模型组明显增加，提示马齿苋通过增加FLG基因表达，增加FLG水平，恢复角质细胞“砖块”结构的支架作用，从而降低TWEL，恢复皮肤屏障功能，达到治疗急性湿疹的目的。

FLG基因的无义突变使FLG减少或缺失，这可引起天然保湿因子减少，导致皮肤表面偏碱性。表皮pH值的改变可激活PAR-2，降低表皮脂质的水平，增加TWEL，破坏皮肤屏障功能。本实验发现，用药后，马齿苋组中PAR-2表达较模型组降低，FLG基因表达增加，提示作为急性湿疹的治疗靶点，不仅PAR-2的活性改变会影响治疗效果，其水平的改变也可能影响疗效。

综上所述，马齿苋可能是通过增加FLG基因表达，降低PAR-2水平，减少TEWL，恢复皮肤屏障功能，从而发挥治疗急性湿疹的作用。马齿苋是否还可能是通过增加FLG基因的表达来抑制PAR-2的活性，达到恢复皮肤屏障功能治疗急性湿疹的作用，有待进一步研究。