瑞舒伐他汀对兔急性心肌梗死后心肌重构的作用及功能影响的机制研究*

武鑫玲，姜 娟

(1.郑州人民医院心血管内科，郑州 450053；2.北京大学人民医院老年医学科，北京 100044)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心内科常见疾病之一，预后较差，具有较高的病死率，给人们的健康带来严重威胁。AMI是由于心脏的供血血管发生急性闭塞，影响相应的心肌组织的血供而导致短时间内出现缺血、缺氧，甚至发生坏死[1]。传统观点认为，AMI时心肌组织的损伤为不可逆。而最近研究表明，哺乳动物的心肌细胞在AMI时仍未退出细胞周期，因此仍具有再生能力[2-3]。患者的心脏功能在AMI发生早期受到调节会发生心肌重构。他汀类药物是目前临床降脂、降压的常用药物。研究显示，他汀类药物有助于改善心肌重构。瑞舒伐他汀是一种他汀类药物，具有稳定冠状动脉粥样硬化斑块、抗炎、维持内环境稳定，从而发挥调节细胞增殖，保护心肌细胞的作用[4-5]。本研究通过AMI大白兔模型的建立，观察他汀类药物对兔AMI后心肌重构的作用，并探索其中的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器与试剂 HPSonos 5500超声诊断系统(美国HP公司)，美国ABI9700RT-PCR扩增仪(美国Thermo公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制药有限公司，批准文号H20110563)，基质金属蛋白(MMP)-2、-9、-10，骨膜蛋白(Perionstin蛋白)及转化生长因子(TGF)-β1兔多克隆抗体(美国BD公司)。

1.1.2实验动物 大白兔，雄性，18个月龄，体质量(2.41±0.11)kg，合格证号[SCXK(苏)2007-0008]，适应性饲养1周，室温，湿度45%～70%，自由进食饮水。

1.2方法

1.2.1造模与给药方法 首先麻醉兔，于腹腔注射20%乌拉坦(0.4 mL/kg)，固定兔子仰卧于手术台上，将颈部及胸部被毛剪除，将颈部皮肤纵形剪开1.5～2.0 cm，对于皮下组织及肌肉进行分离，使气管及其上甲状腺腺体显露；钝性分离气管并带线，将丝线提起，于气管环之间将气管剪开半周，行气管插管；对呼吸参数，包括呼吸频率、吸呼比及潮气量进行调整；胸骨左缘3 mm将胸部皮肤纵形剪开约4 cm，对皮下、胸大肌与前锯肌进行钝性分离，对胸大肌及前锯肌进行缝合、牵开，使肋骨及肋间肌显露，将肋间肌于第3肋间逐步剪开，使胸膜显露，于呼气时刺破胸膜进入胸腔；撑开肋骨，显露心脏；探查确定左心耳，结扎冠状动脉左前降支近端，13 mm针Prolene线缝扎，出针，打结，探查无出血后关胸，将一根吸引管留置于胸腔内，缝合肋间对术野进行消毒；对合胸大肌与前锯肌并缝合，将胸腔积气积液用针筒抽吸，将吸引管拔出；兔子苏醒后，拔管，对气道血块及分泌物进行清理，气管切口以Prolene线一针缝合，碘伏消毒术野，对合肌肉及皮下，缝合颈部切口。手术后24 h内11只大白兔死亡。将存活的69只兔子分为3组：心肌梗死对照组(MI组，n=20)、瑞伐他汀组(R组，n=22)、假手术组(S组，n=27)。S组并不在冠状动脉处结扎仅穿线；R组兔子灌胃给予10 mg·kg-1·d-1瑞舒伐他汀钙，每日1次，灌胃处理4周；MI组建立AMI后不予任何操作。

1.2.2超声心动图检查 干预结束使用HP Sonos 5500超声诊断系统(频率12 MHz)对3组大白兔进行超声心动图检查。检测指标包括左心室射血分数(LVEF)、左心房直径(LAD)、左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室短轴缩短率(LVFS)等。

1.2.3左心室梗死面积计算 将左心室切片置于1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中染色30 min，蒸馏水冲洗后，心肌梗死区未着色显示灰白色，非梗死区经过染色后显示深红色。采用ImagePro Plus软件(version 6.0)计算梗死面积和左心室总面积，以梗死面积/左心室总面积表示梗死面积的大小。

1.2.4检测细胞凋亡率 常规TUNEL法，由福建迈新生物技术开发有限公司提供试剂盒，检测心肌组织中的凋亡细胞。光镜观察细胞核棕色为阳性，凋亡指数 (AI) =视野凋亡数/视野内细胞总数×100%。

1.2.5检测心肌梗死边缘区Caspase-3的表达 将心肌组织用机械法剪碎，过滤并制成单细胞悬液，将5 mL单细胞悬液加入试管中，常规离心后去上清液，加入100 μL固定液后混匀，静置15 min。加4 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，常规离心，去上清液，加入100 μL裂解液，室温静置入5 min。加5 μL美国Santa Cruz Biotechnology的Caspase-3抗体，混匀，避光静置15 min。加4 mL PBS，离心，去上清液，加PBS 0.5～1.0 mL。使用日本BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪检测。

表1 3组大白兔超声心动图指标比较

a：P<0.05，与S组相比；b：P<0.05，与MI组相比

1.2.6检测p-p38蛋白和p38 常规方法提取样品蛋白，标化后聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜后，以5%的脱脂牛奶1∶200稀释兔单抗p-p38抗体(美国Santa Cruz Biotechnologyy)、兔单抗p38抗体(美国Santa Cruz Biotechnology)，1∶1 000稀释兔多抗actin抗体(武汉博士德公司)；置摇床4 ℃孵育过夜;将辣根过氧化物酶(HPR)标记的鼠、兔二抗用5%脱脂牛奶1∶200稀释，常温摇床上孵育聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，之后于凝胶成像系统曝光。

2 结 果

2.13组大白兔超声心动图指标比较 3组间超声心动图指标比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与S组相比，MI组与R组的LAD、LVDd和LVDs均显著增加，同时LVEF和LVFS降低(P<0.05)；R组LAD、LVDd和LVDs与MI组比较差异无统计学意义(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI组(P<0.05)，见表1。

2.23组大白兔心肌梗死面积比较 S组心肌梗死面积为0，MI组(37.92±4.29)%与R组(36.71±3.98)%间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3瑞伐他汀对兔子心肌梗死边缘区细胞凋亡的影响 MI组[(24.42±2.52)%]和R组[(9.31±0.31)%]凋亡指数 (AI)显著高于S组[(2.65±0.32)%](P<0.05)，R组AI较MI组显著降低(P<0.05)。

2.4不同组心肌梗死边缘区Caspase-3的表达情况 R组及MI组心肌梗死边缘区Caspase-3表达较S组明显升高，而R组较MI组显著降低(P<0.05)，见图1。

2.5不同组心肌梗死边缘区相关蛋白表达情况 MI组、R组、S组p38表达均未见明显差异，MI组和R组p-p38表达较S组显著升高，而R组较MI组显著降低(P<0.05)，见图2。

a：P<0.05，MI组与S组比较；b：P<0.05，R组与MI组比较；c：P<0.05，R组与S组比较

图1各组心肌梗死边缘区Caspase-3的表达

A：Western blot法检测兔心肌梗死边缘区p38、p-p38的表达；B：半定量分析；a：P<0.05，S组与MI组比较；b：P<0.05，R组与MI组比较；c：P<0.05， R组与S组比较

图2各组兔心肌梗死边缘区p38、p-p38的表达

3 讨 论

AMI后心肌细胞受损，导致心室肥厚、扩张，心肌收缩力下降，心肌纤维化增加，最终导致心力衰竭，给患者带来严重后果[6-7]。本研究中建立AMI大白兔模型，以探究AMI的发病机制，以及可能存在的病理变化。

本研究在对兔子模型进行不同干预4周后行超声心动图检测，结果显示，与S组相比，MI组与R组的LAD、LVDd和LVDs均显著增加，同时LVEF和LVFS降低(P<0.05)，说明大白兔在心肌梗死后出现心脏扩大、左心室收缩功能不全。另外，R组LAD、LVDd和LVDs与MI组比较差异无统计学意义(P>0.05)，LVEF和LVFS高于MI组(P<0.05)，提示瑞舒伐他汀能増强心肌梗死大白兔的左心功能。但MI组与R组间的心肌梗死面积比较并未见显著差异(P>0.05)，提示瑞舒伐他汀并不能达到显著地减少心肌梗死面积的目的。

心室重构是心肌细胞凋亡所引起，有研究发现，心肌梗死大鼠除梗死区外，梗死边缘区及非梗死区亦可检出细胞死亡，而这是引起左心室重塑和晚期心功能不全的重要因素[8-9]。本研究结果显示，R组心肌细胞AI较MI组显著降低(P<0.05)，提示瑞伐他汀治疗能减少心肌细胞凋亡，可能通过抑制心肌凋亡，而使心功能改善。

目前认为他汀类药物可能通过抑制心肌凋亡而使心功能改善，分析其抑制心肌细胞凋亡可能的作用机制[10-12]：(1)通过抗氧化作用抑制心肌凋亡；(2)通过调控丝氨酸-苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇-3激酶，下调Caspase-3 活性。Caspase-3在细胞的凋亡中起关键作用，是凋亡途径中的执行者。p38属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中的一个主要成员，研究发现，大鼠心肌梗死后，p38并未增高，但p-p38在心肌梗死后7 d时升高2倍以上，p-p38能激活凋亡程序中最后的执行者Caspase-3的活性，使凋亡通路启动，活化的Caspase-3又能导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞发生凋亡[13-15]。本研究中，R组p-p38、Caspase-3的表达低于MI组，推测瑞舒伐他汀可能通过抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心功能。结果表明瑞舒伐他汀能抑制心肌凋亡、改善心功能，但无法逆转已梗死的心肌组织，提示已坏死的心肌组织无法通过药物恢复正常功能。因此，早期对AMI患者使用保护心肌细胞药，避免梗死进一步加重是改善患者预后、提高生存率的重点。

综上所述，瑞舒伐他汀可以使AMI大白兔的心脏功能显著改善，可能通过抑制p38的磷酸化，抑制Caspase-3活化，抑制心肌细胞凋亡，改善心室重构。