细胞饼瞬时表达体系的优化

韩 娟，缪国鹏，张科贵，汪承润，王顺昌

（淮南师范学院，安徽淮南2320385）

当前，临床使用的重组蛋白类药物大多数来自于哺乳动物细胞和大肠杆菌表达生产平台，少部分来自酵母和昆虫细胞。但这些常用的表达系统有其明显的缺陷，主要表现为高生产成本、低效率、低产率。另外，哺乳动物作为主要的真核表达系统，还涉及到病原菌污染等严重安全性问题。这就需要一种高表达、经济实用、安全性高的新的表达系统来生产这些重组蛋白[1]。与哺乳动物细胞类似，植物细胞同样拥有内膜系统，因此可以利用分子伴侣折叠和组装重组蛋白。而与动物表达系统相比，植物表达系统有若干优势，如缺少动物病原性的污染物、价格低廉及便于扩大性生产等[2]。

作为生物反应器来生产外源蛋白的植物生产平台，可以是转基因植株，也可以是悬浮培养细胞，可以是永久表达，也可以是瞬时表达，每一种系统各有优缺点[3]。转基因植物的细胞悬浮培养生产重组蛋白的方法集合了完整植株培养和微生物发酵、动物细胞培养的很多优点。悬浮细胞既能像微生物一样能在廉价的培养基上生长，生物量倍增时间短；又能像动物细胞培养一样合成较复杂的多聚体蛋白和糖蛋白，如免疫球蛋白等。同时，植物悬浮培养细胞与转基因植株一样能进行蛋白质的正确加工、修饰、折叠等，不携带人类病原菌，不产生内毒素，容易规模化放大。更为重要的是，细胞悬浮培养在人工控制的条件下进行，并使用与传统微生物和哺乳动物细胞培养类似的生物反应器，一方面不存在基因漂移等环境安全问题，另一方面容易通过GMP认证[4]。正因如此，第一个成功注册的植物源药用蛋白（Elelyso®）就是以植物细胞培养作为平台的。

然而，稳定转化的悬浮细胞中重组蛋白的产量往往较低。因此，研究人员对悬浮细胞的瞬时表达技术进行过较为系统的研究。真空渗漏法（Agroinfiltration）通过机械法促进农杆菌深入植物叶肉细胞间隙，是当前植株瞬时表达领域应用最为广泛的技术[5-6]，然而却无法用于悬浮细胞。在植物双元表达载体中引入病毒相关蛋白实现的Magnifection技术由于依赖胞间连丝实现胞间转染，而悬浮细胞的胞间连丝基本处于退化和断裂的状态[7]，因此也不适用于悬浮细胞。近期，Sukenik等将农杆菌直接加入至植物悬浮细胞培养体系中，并通过优化参数得到了瞬时转化效率的一定提升，然而所感兴趣的重组蛋白的总产量仅十几毫克每升[8]。

细胞饼（Cell pack）是通过控制真空度对悬浮细胞进行抽滤后得到的具有一定空隙的饼状细胞团块。在这种细胞饼上进行瞬时转化时具有与农杆菌更多的接触面积，进而具有较高的转化效率[9]。这一技术在工业化生产中还可通过抽滤使细胞形成柱状、层状等再进行转基因操作，具有极大的研究价值。为增强烟草、拟南芥以及生菜等植株的瞬时转化效率，前人对真空度、真空持续时间，农杆菌类型、浓度[10-11]，以及光照、湿度、表面活性剂类型等[12-13]进行了优化。然而，针对细胞饼瞬时转化技术的优化研究却未见报道。

本研究旨在通过对细胞饼瞬时转化技术进行优化，以指导后续可能的工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料

农杆菌：根癌农杆菌LBA4404。

植物材料：烟草BY-2细胞。

主要试剂：链霉素、卡那霉素、利福平、辛硫酸、半胱氨酸、Silwet L-77、Triton X-100、乙酰丁香酮、盐酸。

1.2 载体构建

实验室前期构建得到植物双元表达载体pYBA1132-35S-T载体，其具有eGFP表达盒以及为目的基因插入所准备的多克隆位点。载体经Bam-HI和HindIII双酶切后，通过同源重组与合成的人重组蛋白白介素10（hIL10）基因进行连接，得到重组载体pYBA1132-IL10-EGFP（图1）。

图1 本研究所用植物双元表达载体pYBA1132-IL10-EGFP图谱

1.3 细胞饼制备

将布氏漏斗与真空泵连接成抽滤装置。在超净工作台内，将剪成合适大小的滤纸放置于布氏漏斗上，务必覆盖住全部空隙，开启真空泵。将烟草悬浮细胞倒入布氏漏斗中，抽滤1分钟，再将抽滤好的细胞饼倒扣在玻璃培养皿中。为消除抽滤操作带来的误差，将每个细胞饼切成均等的四份（图2），并分别进行称重。每种处理及对照设置四个重复。

图2 细胞饼制备以及处理

1.4 瞬时转化

重组质粒经热击法转化根癌农杆菌LBA4404后，利用卡那霉素、链霉素和利福平筛选阳性克隆并进行验证。挑取阳性克隆培养后冻存。取复苏的农杆菌以2%接种量接种至250 mL YEB培养基中，置于150 rpm、28℃的摇床上培养至OD值为0.5或1.0。离心收集菌体，用加有100 μM乙酰丁香酮的MS培养基重悬。为探讨抗氧化剂与表面活性剂对转化效率的影响，分别在上述菌液中加入不同浓度或类型的抗氧化剂以及表面活性剂。对于半胱氨酸，菌液中分别加入终浓度为0.1 g/L和0.5 g/L的半胱氨酸（0.1 M盐酸配制100 g/L母液），以溶剂0.1 M盐酸为对照，另设不加菌液的阴性对照。辛硫酸用乙醇配制为100 mM母液，处理浓度为10 μM和100 μM，乙醇做对照，另设不加菌液的阴性对照。表面活性剂选取两种，即Silwet L-77以及Triton X-100，加入菌液中的终浓度为0.01%或0.05%（v/v）。每克细胞饼用0.55 mL菌液或对照溶剂浸润，将培养皿放入28℃，85%相对湿度的生化培养箱培养3天或5天。

1.5 蛋白提取与含量测定

在特定时间收获烟草细胞，以1 mL/g向细胞中加入蛋白提取液（加有5 mM EDTA以及5 mM β-巯基乙醇的pH 7.4磷酸缓冲液）进行研磨与蛋白提取。离心得到蛋白提取液进行GFP荧光强度的测定。GFP荧光强度测定在酶标仪中进行（Hitachi Model F-2500,Japan），488 nm激发并测定509 nm发射光强度。用未加菌样品的荧光信号做背景扣除，外标法定量。

采用蛋白质印迹对IL10进行定性，一抗选用兔抗人IL10单克隆抗体（Cat:10947-R001，Sino Biological，China），二抗选用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体（A0208，碧云天，中国）。IL10的定量反应参照ELISA试剂盒说明书进行（Cat:KIT10947A，Sino Biological，China）。

1.6 数据处理与统计分析

实验数据表示为4个重复的平均值。利用SPSS软件（IBM，美国）计算标准差以及进行方差分析。置信水平设置为95%或99%。

2 结果

2.1 农杆菌菌液浓度与培养时间对转化效率的影响

本研究采用了两种菌液浓度，OD值分别为0.5和1.0，其对应的菌体浓度约为0.5×109以及1.0×109cfu/mL。实验结果表明，随初始菌液浓度以及共培养时间的增加，GFP的含量也随之增加。在OD值为1.0时，处理5天后GFP的含量达到最大值，16.78±1.21 μg/g FW（图3）。然而，当培养至7天时，局部的细胞饼出现了褐化死亡，因此未对指标进行测定。选取菌液浓度为OD 1.0，培养时间为5天进行后续优化实验。

图3 农杆菌菌液浓度以及培养时间对细胞饼瞬时转化生产GFP的影响

2.2 抗氧化剂对转化效率的影响

为探讨抗氧化剂对细胞饼转化效率的影响，本研究选取了半胱氨酸和硫辛酸两种试剂。半胱氨酸的添加对转化效率的影响与浓度相关：低浓度的半胱氨酸（0.1 g/L）对转化效率有一定的提升作用，然而高浓度（0.5 g/L）却表现出微弱的抑制作用。使用低浓度半胱氨酸使GFP含量提升至18.38±1.55 μg/g FW（图4）。值得注意的是，由于溶解半胱氨酸的溶剂酸性较大，实验发现，对照溶剂对GFP的含量同样具有一定的抑制作用，虽然在统计学上并不显著。硫辛酸添加对GFP产量的影响与半胱氨酸类似，但效果较半胱氨酸更好。低浓度的辛硫酸（10 μM）处理5天后，GFP的产量达到24.51±2.04 μg/g FW（图4）。

2.3 表面活性剂对转化效率的影响

如图5所示，表面活性剂Silwet L-77以及Triton X-100均可以在不同程度上提高瞬时转化的效率，且提升的效果随表面活性剂的浓度的提升而增加。其中，添加0.05%的Silwet L-77使得GFP的含量提升至最高的35.66±2.57 μg/g FW，是对照的2.13倍。

图4 不同类型抗氧化剂对细胞饼瞬时转化生产GFP的影响

图5 不同类型与浓度的表面活性剂对细胞饼瞬时转化生产GFP的影响

2.4 优化条件下细胞饼中IL-10的产量

为进一步检测上述优化条件的优劣，我们测试了重组蛋白质药物rIL-10的产量。WB结果显示，抗体在21.9 kDa处检测出标准rIL10蛋白，而在细胞提取物中，抗体则在35～45 kDa之间的膜上有明显结合（图6）。由于rIL10蛋白在烟草中常以二聚体形式表达[14]，因此，上述实验结果证实转基因烟草BY-2细胞中确已表达有rIL10蛋白。Marker中意外发现有显影条带，原因可能与其内含有的预染色蛋白质标准有关。ELISA结果表明，rIL10重组蛋白的产量可达到39.37±4.28 μg/g FW，是对照的3.66倍。

图6 WB验证细胞饼中rIL10蛋白的表达

3 讨论

细胞饼制备与转化使悬浮细胞的瞬时转化得以实现，这对于后期工业化生产具有十分重要的意义[15]。然而关于这一体系的参数优化研究尚属空白。

细胞饼技术的发明人Thomas Rademacher在其专利中对细胞饼制备的工艺参数，如真空抽滤时间、细胞饼含水量、环境湿度等进行了优化[9]。由于影响瞬时转化还有诸多因素，我们选取了非常重要的菌液浓度以及添加物进行研究。

农杆菌介导的遗传转化过程中较易产生褐化现象[16]，而对于细胞饼来说，这种褐化情况可能更容易发生。研究表明，在转化过程中加入还原性物质，如L-半胱氨酸、硫辛酸、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸等可减少褐化的产生，同时提升转化效率[16-17]。Wroblewski等[18]在优化拟南芥、生菜以及番茄的瞬时转化效率时发现,高于25 mM的半胱氨酸反而对转化效率具有抑制效果。本研究所用半胱氨酸的浓度分别是0.83 mM以及4.13 mM，均低于前述研究，然而高浓度仍抑制了转化效率。这可能是因为悬浮细胞所形成的细胞饼与叶片细胞在形态、生长状态等诸多方面存在差异，进而使得半胱氨酸的作用性质发生了变化。对于硫辛酸，其原理应也半胱氨酸类似。

表面活性剂可以帮助农杆菌浸润和黏附于植物叶片，因此在植株瞬时转化中被广泛证实具有促进转化效率的作用[19-20]。本研究中，两种测试的表面活性剂，Triton X-100以及Silwet L-77均具有促进转化的作用，而Silwet L-77的作用更为突出。通过在菌液中加入0.1%的Silwet L-77，Hahn等[20]发现去掉真空处理亦可达到90%的叶面转化率。本实验所用的最高浓度只为Hahn等的一半，是否更高浓度具有更优良的效果仍有待进一步研究。

为进一步提升细胞饼瞬时转化技术的应用前景，本研究初步探究了农杆菌浓度、抗氧化剂以及表面活性剂对转化效率的影响，为后续这一技术的应用奠定了一定的理论基础。