肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测 方法的研究

大连市检验检测认证技术服务中心 辽宁大连 116600

表皮葡萄球菌是滋生于生物体表皮上的一种革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名表皮葡萄球菌。在自然发酵肉制品中，表皮葡萄球菌是占据优势地位的葡萄球菌菌种[1～5]，它们在发酵肉制品生产过程中能够产生脂肪酶和蛋白酶，对发酵肉制品风味品质的形成起着重要作用[6]。葡萄球菌属的许多种类其菌落形态、菌体特征相似难辨，生理生化特性也存在许多相似之处，传统的生理生化实验耗时费力，不能满足表皮葡萄球菌检测中的快速、准确、低成本的需要。

目前，随着分子生物学的发展以及PCR技术的出现，许多非培养方式鉴定技术被用于葡萄球菌的鉴定[7～9]。在众多非培养方式鉴定方法中，特异性PCR技术以其快速、准确、简单及低成本等优点备受青睐，已得到了广泛应用[10]。而TaqMan探针的荧光PCR检测具有定量准确、快速、简便、直观的优势，在病原菌检测中得到广泛的应用[11]。因此本研究旨在采用实时荧光PCR技术建立肉制品中表皮葡萄球菌检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本

阳性样本CICC10294表皮葡萄球菌，阴性样本金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌等20株标准菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心。试验所用菌株见表1。

表1 试验用菌株

Table 1 Test strains

序号名称来源菌种号1表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisCICC102942金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusCICC216003鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimuriumCICC214844大肠埃希氏菌Escherichia coliCICC103895蜡样芽胞杆菌Bacillus cereusCICC212616蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoidesCICC214737苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensisCICC229458枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCICC102759铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosCICC2163610粪肠球菌 Enterococcus faecalisCICC2365811荧光假单胞菌Psdeuomnoda fluoerncnetCICC2162412恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaCICC2054113福氏志贺氏菌Shigella flexneriCICC2153414产气荚膜梭菌Clostridium perfringenCICC2294915白假丝酵母Candida albicansCICC196516产气肠杆菌Enterobacter aerogenesCICC2294917阪崎肠杆菌Enterobacter SakazakiiCICC2154418副溶血性弧菌Vibrio ParahemolyticusCICC2161719单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenesCICC2163320马红球菌Rhodococcus equiCICC2295521酿脓链球菌Streptococcus pyogenesCICC10373

1.1.2 试剂

营养肉汤等培养基为北京陆桥公司产品，DNA提取试剂盒为广州双螺旋公司产品，实时荧光PCR反应试剂、Taq酶为宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3 主要仪器

ABI QS7 Flex荧光定量PCR仪，Eppendorf 5427R超低温离心机，上海一恒BWS-12恒温水浴，Promega Quantus DNA分析仪。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针的设计与合成

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列，用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针，探针的荧光标记选择FAM作为报告发光基团，TAMRA为淬灭基团。引物探针由上海生工公司合成。

表2 实时荧光PCR引物及探针序列

1.2.2 DNA模板的制备

将表皮葡萄球菌和其它菌株接种营养肉汤培养基，36℃培养24h。细菌增菌后，用DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA作为实时PCR的模板，-20℃保存。

1.2.3 实时PCR的反应体系和条件

实时荧光PCR扩增采用25μL反应体系，反应用各种试剂采用宝生物工程(大连)有限公司的Premix Ex TaqTM(RR390Q)试剂盒，具体各种试剂浓度、体积见表2。

表3 实时荧光PCR扩增反应体系

实时荧光PCR反应程序为：95℃预变性30s，然后进入循环反应：95℃变性5s、60℃退火和延伸30s，共40个循环。

1.2.4 特异性检测

以金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌等20株细菌作为阴性对照，并用高纯水作为无模板对照验证实时PCR法检测表皮葡萄球菌的特异性。

1.2.5 灵敏度检测

以0.85%生理盐水将表皮葡萄球菌标准菌株做成菌悬液，对菌悬液进行10倍比梯度稀释，形成梯度含菌量为1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL的菌悬液。对每个稀释度取1mL菌悬液进行DNA提取，提取的DNA则进行荧光定量PCR检测。

1.2.6 实际样品检测

选取市售凉拌猪耳朵、凉拌猪肚、生猪肉、酱牛肉、风干牛肉共5个样品，无菌取样25g分别加入营养肉汤培养基中，36℃培养24h。取增菌液1mL提取DNA，利用本研究的实时荧光PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 实时荧光PCR特异性结果

以金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌等20株细菌作为阴性对照，并用高纯水作为无模板对照验证实时荧光PCR法检测表皮葡萄球菌的特异性。实时荧光PCR检测表皮葡萄球菌特异性试验见图1。结果表明，只有表皮葡萄球菌具有扩增曲线，其他20种菌株无扩增曲线。

图1 实时荧光PCR检测表皮葡萄球菌特异性试验Fig.1 Specificity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.2 实时荧光PCR灵敏性结果

分别取1m表皮葡萄球菌1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL、1×102CFU/mL的菌悬液进行DNA提取，提取的DNA进行荧光定量PCR试验。表皮葡萄球菌灵敏性试验见图2。结果显示，表皮葡萄球菌浓度为1×106CFU/mL、1×105CFU/mL、1×104CFU/mL、1×103CFU/mL时均有扩增曲线，浓度低于1×103CFU/mL时无扩增曲线，该方法检测的低限为1×103CFU/mL。

①1×106CFU/mL ②1×105CFU/mL ③1×104CFU/mL ④1×103CFU/mL图2 实时荧光PCR检测表皮葡萄球菌灵敏性试验Fig.2 Sensitivity detection ofqRT-PCR assay for Staphylococcus epidermidis

2.3 实时PCR实际样品检测结果

对凉拌猪耳朵、凉拌猪肚、生猪肉、酱牛肉、风干牛肉共5个样品的营养肉汤增菌液进行DNA提取，以表皮葡萄球菌为阳性对照，进行实时荧光PCR试验。结果显示，凉拌猪肚和生猪肉中检测出含有表皮葡萄球菌(见图3)。

1.蜡样芽胞杆菌 2.生猪肉 3. 凉拌猪肚图3 实时荧光PCR检测样品中试验Fig. 3 Detection of Staphylococcus epidermidis in samples by qRT-PCR

3 讨论

在日常食品检测中，表皮葡萄球菌一般不作为微生物检验的常规指标项目。但该菌抵抗力强，一般消毒剂对其无效，营养要求低，容易在食品中存活并繁殖，存活时间长，多数为非致病菌，少数可导致疾病。随着人们生活水平的提高，对即食类产品需求量不断增加，要求不断提高;加上不同的人群对病菌的抵抗能力不同就容易受到表皮葡萄球菌的影响。所以有必要对该菌进行监控，以提高产品质量，降低该菌引起食品污染的风险。

长期以来，肉制品中表皮葡萄球菌检测主要依据细菌培养、生化鉴定，该方法步骤繁琐，且需要耗时数天的时间。常规PCR方法，虽然能够大大缩短检测周期，但其特异性较差，容易产生假阳性，且需要进行核酸电泳、EB染色等步骤，危害操作人员的健康。基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法具有高特异性、高灵敏性和可计量性，自动化程度高，无需电泳处理无污染性，且具有实时性、快速等特点[12]。

本研究设计含有不同浓度的表皮葡萄球菌(1×106CFU/mL，1×105CFU/mL，1×104CFU/mL，1×103CFU/mL，1×102CFU/mL)菌液样品，试验得到该检测方法的低限为1×103CFU/mL。本研究通过反复摸索，建立了一套切实可行的检测食品中表皮葡萄球菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中表皮葡萄球菌的快速检测奠定了基础。