不同现代月季品种的花粉生活力测定及贮藏方法比较

(江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400)

月季为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶或半常绿灌木，也有蔓状或藤本状，素有“花中皇后”之美称[1-2]。按照美国月季协会1966年的定义，1867年首次育出的杂种香水月季系统的第一个品种后的品种群称为现代月季(RosehybridaHort．)，而1867年之前的品种称为古老月季(RosachinensisJacq.)[3-4]。月季具有极佳的观赏性，种质资源丰富，品种繁多[5]，对气候、土壤要求不严格，但以疏松、肥沃、排水良好的微酸性土壤为宜，喜温暖、空气流通较好的环境栽培。江浙地区夏季具有高湿高热的气候条件，而许多引种栽培的现代月季品种耐热性不好，因此培育耐热性好的月季品种，是现代月季育种的一个重要方向。传统的育种方法主要是通过杂交育种，目前，杂交育种仍然是月季新品种选育的主要途径。父本花粉生活力的高低是影响杂交结实率的一个重要因素，根据花粉生活力的高低选用不同的品种做父本，或采用不同的授粉方式，将能有效提高结实率。因此，在杂交育种前需要对花粉进行生活力测定。在月季花粉生活力测定方面的研究报道较少，目前仅见杨攀等[5]、张颢等[6]、周家杏等[7]、王其刚等[8]、张立磊等[9]的报道。因此，本研究以现代月季的4个品种为试材，选用4种不同的测定方法，对不同贮藏方法下的花粉生活力进行了测定，以期为月季的人工授粉、杂交育种等工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

材料为生长于江苏农林职业技术学院示范园区江苏农博园月季种质资源圃内的4个月季品种：欢笑“Bright Smile”、金奖章“Gold Medal”、粉扇“Fenshan”、绯扇“Hiohgi”。

1.2 方 法

1.2.1花粉的采集

于09：00—11：00时期间选取即将绽放的花蕾，带回实验室，用消毒过的镊子取下花药，将花药置于硫酸纸上，放入硅胶干燥器内，干燥5 h后收集花粉。

1.2.2花粉检测方法的筛选

为了筛选出适宜不同月季品种的花粉生活力检测方法，采用了双因素(品种(4个水平)、染色方法(4个水平))的完全随机组合试验设计，每个处理重复3次。

1) TTC染色法：将待测的花粉置于凹形载玻片上，滴入2滴0.5%TTC溶液，用镊子轻轻搅荡使花粉均匀散开后轻轻盖上盖玻片，置于30 ℃的恒温箱中30 min，然后在显微镜下观察，有活力的花粉被染成红色[7]。

2) 醋酸洋红染色法：利用1%的醋酸洋红做为染色液，方法同TTC法，染完后将载玻片置于30 ℃下放置10 min，有活力的花粉被染成深红色，没有活力的花粉呈浅红色或无色。

3) 亚甲基蓝染色法：用0.1%的亚甲基蓝溶液进行染色，染色后静置1～2 min，然后镜检，凡是染成蓝色的表示有生活力，没有着色或者着色过浅者为丧失生活力的花粉[7]。

4) 碘-碘化钾染色法：将1 g KI溶于10 mL蒸馏水中，加入0.5 g I2，待其全部溶解后，加蒸馏水至200 mL，配好试剂后，贮于棕色瓶中备用[10]。将花粉置于载玻片，滴2滴I2-KI溶液，置于30 ℃恒温箱中30 min，在显微镜下观察，有生活力的花粉染成蓝色，生活力衰弱或内含物少的花粉呈黄褐色[5]。

以上染色方法，观察时每个载玻片均统计3～5个视野，共统计100粒花粉，计算染色率作为花粉生活力，每种染色法均重复3次。

1.2.3贮藏方法对花粉生活力的影响

将收集的不同品种花粉分别装入冷冻管中，每品种均选用4种方法进行贮藏：常温即将装有花粉的冷冻管直接置于室温下；常温干燥，将花粉置于装有硅胶的干燥器内贮藏；低温干燥，将花粉置于干燥器中再放在4 ℃低温下贮藏；冷冻贮藏，将花粉置于-20 ℃的冰箱中贮藏[11-12]。观察方法：常温贮存的每天进行观察；低温干燥的每3 d观察1次；冷冻贮藏的每隔7 d观察1次。花粉均采用亚甲基蓝染色法，观察时每个载玻片均统计3～5个视野，共统计100粒花粉，计算染色率作为花粉生活力，每种处理重复3次，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 不同检测方法的比较

由于不同品种花粉形态大小、营养物质等的差异，花粉生活力差异也较大。同一品种采用不同的检测方法检测出的花粉生活力不同。图1显示，4个品种均以TTC检测法的花粉生活力最低，欢笑以碘-碘化钾和醋酸洋红检测出的花粉生活力最高，分别为62.0%和60.2%，差异不显著；金奖章以碘-碘化钾检测的生活力最高，为69.3。粉扇以亚甲基蓝检测的成活率最高，为72.0%，醋酸洋红检测的成活率为65.3，且两者差异不显著，绯扇以亚甲基蓝检测成活率最高，为78.2%，且与其它检测结果差异显著。结果表明，4个品种花粉的检测不适宜用TTC，欢笑和金奖章适宜用碘-碘化钾检测，粉扇和绯扇适宜用亚甲基蓝检测。

2.2 不同贮藏方法的花粉生活力比较

2.2.1常温贮藏

常温贮藏条件下，花粉生活力每天进行观测，均选用亚甲基蓝作为染色剂，对比常温贮藏和常温干燥贮藏对花粉生活力的影响。具体结果见表1。

表1 常温贮藏花粉生活力变化情况

贮藏方法品种0d(%) 1d(%)2d(%)3d(%) 4d(%) 5d(%)6d(%)常温欢笑51.349.736.718.28.76.72.0金奖章56.740.732.020.414.37.31.3粉扇72.050.034.720.212.05.41.3绯扇78.256.036.024.214.76.23.0常温干燥欢笑51.350.744.026.716.013.37.3金奖章56.747.340.724.723.318.09.3粉扇72.050.046.024.719.312.76.0绯扇78.256.049.228.722.014.29.2

图1 不同品种花粉生活力比较

利用反正弦转换后的数据进行独立样本等方差t检验，对常温与常温干燥贮藏方法下的花粉生活力进行分析，得出t=-0.981，显著性(双尾)p=0.331>0.05所以，常温与常温干燥贮藏方法下花粉生活力没有显著差异。

2.2.2低温冷藏

低温冷藏条件下，花粉生活力每3 d观察1次，连续观察6次，具体结果见表2。

表2 低温冷藏下的花粉生活力

品种0d(%)3d(%)6d(%)9d(%)12d(%)15d(%)欢笑51.341.332.028.011.38.4金奖章56.740.732.729.316.012.2粉扇72.048.024.026.012.07.4绯扇78.254.728.727.313.38.2

对上述数据经反正弦转换后，进行“分析一般线性模型-单变量”的双因素方差分析，试验因素分别为品种(4水平)、时间(6水平)。

结果表明，品种间F值为1.038，显著性p值为0.404<0.05，即品种间花粉生活力差异不显著；不同贮藏时间间的F值为49.851，显著性p值为0.000<0.05，即不同贮藏时间间存在显著差异。S-N-K多重比较结果见表3。

表3 贮藏时间的多重比较

贮藏时间(d)转换后的平均数反转换的成活率(%)053.703a65.0342.795b46.2632.764c29.3931.719c27.61221.219d13.11517.429d9.0

以贮藏时间为横轴，对各品种的花粉生活力平均值作图，如图2所示，随着低温冷藏时间的延长，各品种的生活力均呈现出明显的下降趋势，贮藏15 d后各品种成活率降至10%左右，而4种花粉的生活力降幅差异并不明显。

图2 不同贮藏时间下各品种的生活力变化趋势

2.2.3低温冷冻

低温冷冻条件下，花粉生活力每隔7 d观察1次，连续观察5次，具体结果见表4。

表4 低温冷冻下的花粉生活力

品种第0天(%)第8天(%)第15天(%)第23天(%)第30天(%)欢笑51.336.719.37.20金奖章56.728.723.312.43.2粉扇72.030.724.08.30绯扇78.231.323.29.21.2

对上述数据经反正弦转换后，进行“分析-一般线性模型-单变量”的双因素方差分析，试验因素分别为品种(4水平)、时间(6水平)。

结果表明，品种间F值为1.082，显著性p值为0.394<0.05，即品种间花粉生活力差异不显著；不同贮藏时间间的F值为72.856，显著性p值为0.000<0.05，即不同贮藏时间间存在显著差异。S-N-K多重比较结果见表5。

以贮藏时间为横轴，对各品种的估算边际平均值作轮廓图，如图3所示，随着贮藏时间的延长，各品种的生活力均呈现出明显的下降趋势，而各品种成活率的趋势线几乎平行，代表品种间差异不显著。

表5 不同贮藏时间的多重比较

贮藏时间(d)转换后的平均数反转换的成活率(%)053.703a65.0834.336b31.81528.263b22.42317.656c9.2304.149d0.5

图3 不同贮藏时间各品种的生活力趋势

2.2.4冷藏与冷冻处理的花粉生活力比较

以贮藏15 d的冷藏和冷冻2种处理方法的花粉生活力进行比较，结果见表6。

表6 冷藏与冷冻处理结果比较表

品种冷藏(%)冷冻(%)冷冻/冷藏欢笑8.419.32.3金奖章12.223.31.9粉扇7.424.03.2绯扇8.223.22.8

从表6中可看出，贮藏15 d后，冷冻处理和冷藏处理下，各品种的花粉生活力明显不同，总趋势为冷冻贮藏的花粉生活力明显高于冷藏处理的，冷冻处理的生活力是冷藏处理的生活力的2～3倍。

3 结论与讨论

3.1 不同检测方法的比较

试验中检测的4个品种的花粉由于形态大小、营养物质等的差异，花粉生活力差异也较大。同一品种采用不同的检测方法检测出的花粉生活力不同。4个品种均以TTC检测法的花粉生活力最低，碘-碘化钾、醋酸洋红、亚甲基蓝检测的结果都较高，分析不同检测方法的差异性，得出欢笑和金奖章适宜用碘-碘化钾检测，成活率最高，分别为62.0%和69.3%，粉扇和绯扇适宜用亚甲基蓝检测，成活率最高，分别为72.0%和78.2%。

3.2 不同贮藏方法的花粉生活力比较

常温贮藏与常温干燥贮藏方法下花粉生活力没有显著差异。但温度条件对花粉生活力的影响较为显著，低温条件下能明显延长测试品种的花粉生活力，低温冷冻条件下贮藏15 d，花粉生活力仍能超过20%，而低温冷藏仅不足10%，常温贮藏条件下无论常温干燥还是直接的常温贮藏6 d后降至10%以下，因此，贮藏温度越低花粉的贮藏效果越好，究其原因是贮藏温度降低，花粉呼吸强度和酶活性随之降低[13-14]的缘故。

因此，在进行月季杂交育种时，父母本花期不遇时可在低温冷冻条件下贮藏父本花粉，以维持其旺盛的生活力。由于4种花粉的生活力差异不显著，在父本花粉的选择上可以直接根据育种目标进行亲本的选择。