兰州百合糖蛋白LGP－2的提取纯化及结构表征研究*

王铖博 慕星星 石继鹏 陈佩佩 张 继

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

兰州百合（Lilium davidii var. unicolor Salisb.）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）川百合的一个变种，为多年生鳞茎类草本，植物具有很高的食用、药用和观赏价值，是我国卫生部首批审批通过的药食两用植物之一［1］。研究表明，兰州百合中富含糖、蛋白质、维生素、生物碱、黄酮等生物活性物 质［2］。

糖蛋白（glycoprotein）是糖类与多肽或蛋白质通过共价键连接而形成的结合蛋白， 是生物体内重要的一类大分子［3］。糖蛋白种类繁多，广泛存在于生物体内，研究表明，80%以上的蛋白质都是糖蛋白，包括许多激素、免疫球蛋白、结构蛋白、载体蛋白、受体等。 糖蛋白具有多种生物学活性，例如抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等［4－5］。

目前，国内外学者对兰州百合中糖和蛋白质等生物活性物质已进行很多研究，但对生物活性大分子糖蛋白，却鲜有文献进行报道。 本文提取纯化兰州百合糖蛋白（glycoprotein of Lilium davidii var.unicolor Salisb.，LGP），并对其结构进行表征，可为LGP 的后续研究提供参考， 也为兰州百合的进一步开发利用提供更加广阔的前景。

1 材料和仪器

1.1 材料 兰州百合采自甘肃省兰州市七里河区西果园百合种植基地。

1.2 主要仪器 Nicoletis10 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo 公司），JD500－3 电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），UV 9100b 紫外－可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司），LGJ－18S 真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司），L－535R 离心机（湘仪离心机厂），JRA－6 数显磁力搅拌水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司），BSZ－100 自动部分收集器（上海青浦沪西仪器厂），HL－2恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

1.3 试剂 石油醚（沸程30 ～60℃，烟台市双双化工有限公司），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），硫酸铵（莱阳市双双化工有限公司），苯酚（中国医药集团上海化学试剂公司），浓硫酸（广州德树化工有限公司），溴化钾（天津市光复精细化工研究所），Sephadex G－200 凝胶（北京索莱宝科技有限公司），DEAE－Cellulose 52 阴离子交换柱（北京索莱宝科技有限公司），MD77 透析袋 （截留分子量8 000～14 000，北京索莱宝科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 兰州百合糖蛋白的提取纯化

2.1.1 LGP 的提取［6］将新鲜兰州百合鳞片洗净后，于60℃烘箱中烘干后粉碎，过100 目筛；使用pH＝7.4 的0.01 mol/L PBS 缓冲溶液在50℃水浴条件下提取百合糖蛋白，提取时间为2 h；提取液经4 000 r/min 离心，取上清液40℃浓缩；浓缩液加入硫酸铵盐析，离心，收集沉淀；沉淀复溶后以蒸馏水透析除去其中的盐分， 滴加10% BaCl2溶液检测透析终点； 除盐后的样品使用真空冷冻干燥，得到LGP 的粗提物。

2.1.2 LGP 粗品的纯化［7］将糖蛋白粗品溶于pH ＝7.4 的PBS 缓 冲溶液 中，上样 至Sephadex G－200 层析柱，使用超纯水进行洗脱，上样量为20 mL，流速为0.5 mL／min，考马斯亮蓝法595 nm处检测蛋白质流出，苯酚－硫酸法490 nm 处检测多糖，收集多糖和蛋白质均检出部分。

上样至DEAE－Cellulose 52 阴离子交换柱，NaCl溶液梯度洗脱（0 mol／L、0.1 mol／L、0.2 mol／L、0.4 mol／L、0.6 mol／L、0.8 mol／L 及1.0 mol／L），考马斯亮蓝法和苯酚－硫酸法测定蛋白质和多糖含量，按照洗脱梯度收集两者均检出管。 去离子水透析4 d，浓缩后真空冷冻干燥，即获得纯化LGP。

2.2 兰州百合糖蛋白的结构表征

2.2.1 高效液相色谱（HPLC）分析［8］高效液相色谱系统，Silversit C18 色谱柱（250×416 mm，5 μm），紫外检测波长280 nm，流动相为双蒸水，进样量20 μL，柱温30℃，流速为0.7 mL／min，记录样品色谱曲线。

2.2.2 红外光谱（FT－IR）分析［9］LGP 的红外光谱分析采用KBr 压片法。 取充分干燥的LGP 与KBr 按质量比1∶100 进行压片， 用Thermo Nicolet iS10 红外光谱仪在400～4 000 cm－1波数范围内扫描16 次，分辨率为4 cm－1。

2.2.3 分子量测定 LGP 分子量采用体积排阻色谱－光散射联用（SEC－LLS）进行测定。 检测器为多角度激光光散射仪（DAWN Eos，Wyatt Technology Co.，USA），λ=690 nm； 色 谱 柱 为UltrahydrogelTMcolumn（7.8×300 mm，Waters，USA）；以及示差折光检测器 （DAWN Eos，Wyatt Technology Co．，USA）。检测样品浓度为2.0 mg／mL， 样品检测前经孔径为0.2 μm 过滤器过滤。

2.2.4 糖肽键类型［10］糖蛋白的糖肽键类型判断方法，主要采用β－ 消去反应。 将LGP 置于0.2 mol/L NaOH 溶液中，于45℃保温3 h，测定其紫外吸收光谱， 同时以未用碱处理的相同浓度LGP 为对照，测定其紫外吸收光谱。

2.2.5 圆二色性光谱（CD）分析［11］LGP 样品使用蒸馏水溶解，配制成一定浓度的溶液，用圆二色性光谱仪观察其不对称活性， 以判断其蛋白质二级结构。

3 结果与分析

3.1 百合糖蛋白的纯化 由图1 可知，LGP 粗品经Sephadex G－200 柱初步纯化后，糖含量和蛋白质含量相关联的高峰只有一个， 收集后做进一步纯化。

图1 兰州百合糖蛋白（LGP）的Sephadex G-200 洗脱曲线

图2 为LGP 的DEAE-Cellulose 52 柱洗脱曲线。如图所示，经NaCl 溶液梯度洗脱后，收集到2 个纯化糖蛋白组分，分别命名为LGP-1 和LGP-2。 其中LGP-1 由超纯水洗脱获得，LGP-2 由0.1 mol／L NaCl 溶液洗脱获得。

本文以LGP-2 为研究对象，对其做了一系列的结构表征。

图2 兰州百合糖蛋白（LGP）的DEAE-Cellulose 52 洗脱曲线

3.2 结构表征

3.2.1 高效液相色谱分析 图3 为LGP-2 的HPLC 色谱图。 在紫外280 nm 检测条件下，LGP-2在保留时间为2.50667 min 处出现一个单一对称洗脱峰，说明得到的LGP-2 是单一组分的糖蛋白［12］。

图3 LGP-2 组分的HPLC 色谱图

3.2.2 红外图谱分析 由图4 可知，LGP-2 在4 000～400 cm-1范围内的红外吸收光谱表现处典型的多糖和蛋白质吸收峰。其中，波数在3 700 cm-1到3 200 cm-1之间的强而宽的吸收峰是O-H 的伸缩振动峰和N-H 基团的伸缩振动；2 972.20 cm-1和2 923.11 cm-1处则为C-H 的伸缩振动和弯曲振动［13］；1 635.56 cm-1为酰胺基团中的C=O 的吸收峰［14］；1 384.62 cm-1处的峰则证明了有羧基（-COO-）的存在［15］；1 048.65 cm-1的吸收峰则表明糖链存在吡喃糖构型；876.72 cm-1则表明LGP-2 中存在β-糖苷键［10］。

图4 LGP-2 的红外吸收光谱图

3.2.3 糖肽键类型 O-糖肽键在稀碱环境中易发生β-消去反应，导致与糖链连接的丝氨酸和苏氨酸转变为α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸，在240 nm 处产生明显的紫外吸收，因此，对比样品在反应前后在240 nm 处的紫外吸收有无变化即可确定糖蛋白中是否存在O- 糖肽键［16］。

图5 β-消去反应前后LGP-2 的紫外扫描图

由图5可知，LGP－2 经稀碱处理后，紫外240 nm 波长处吸光值发生了明显的变化， 发生了β－消去反应，从而说明LGP－2 含有O－连接糖肽键。

3.2.4 分子量测定 通过SEC－LLS 自带软件分析可知，LGP－2 重均分子量（Mw）为9.311×104，数均分子量（Mn）为3.685×104，多分散系数（Mw／Mn）为2.527。

3.2.5 圆二色性光谱 一般将蛋白质的圆二色性光谱分为远紫外区（185～245 nm）和近紫外区（245～320 nm）。 远紫外区是肽键的吸收范围，反映了主链构象。在远紫外区，天然蛋白质的圆二光谱包括一个正峰（在190 nm 左右）和一个负槽（在205～235 nm 范围）。 其中负槽的形状与主链构象密切相关。

图6 LGP-2 的圆二光谱图

从图6 可以看出，LGP－2 在196 nm 左右有一个正峰， 在210～220 nm 之间有一个负槽， 说明LGP－2 的主链结构以β－折叠为主［11］。

4 结论

本实验以兰州百合为原料提取其中糖蛋白，经过DEAE－52 和Sephadex G－200 色谱柱分离得到LGP－1 和LGP－2 2 种糖蛋白组分。经过FT－IR推断糖蛋白LGP－2 官能团结构、β－消去反应确定糖肽键类型、CD 光谱分析主链二级结构、SECLLS 测定糖蛋白分子量。结果表明：LGP－2 具有多糖和蛋白质的特征吸收峰，且糖链中含有吡喃环，以β－糖苷键连接； 糖和蛋白质之间存在O－连接的糖肽键； 蛋白质主链二级结构以β－折叠为主；LGP－2 重均分子量为9.311×104。