利用固定化技术探究光质对小球藻的影响*

郑耀贤 王爱东 胡佳娜

［1 北京师范大学（珠海）附属高级中学 广东珠海 519080 2 珠海市唐国安纪念学校 广东珠海 519080］

小球藻（Chlorella sp.）是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门、绿藻纲、小球藻属。 小球藻具有生态分布广、易于培养、生长速度快等优点，是进行生物技术研究和环境科学研究的好材料［1］。 著名的卡尔文循环就是用小球藻做实验材料， 最终探明了二氧化碳中的碳在光合作用中转化为有机物中碳的途径。“探究不同环境因素对光合作用的影响”是2017 版高中生物学课程标准中，为帮助学生达成对概念2（细胞的生存需要能量和营养物质，并通过分裂实现增殖）的理解，促进学生生物学学科核心素养提升，要求开展的教学活动。

固定化细胞是指用物理或化学方法使细胞成为不易从载体上流失的形式， 制成生物反应器用以催化生化反应、细胞数量的增殖等。与游离细胞相比，固定化细胞的优点表现为：细胞固定化载体为微生物生长提供了充足有效的空间； 保证了生物反应器内较高的细胞浓度，使得反应速度加快。藻类的生物量受到很多因素的影响， 例如光照、pH 值、氮、磷、重金属含量等的影响［2］。 光质会影响植物的光合作用， 但是光质对固定化小球藻的影响尚未见报道， 本实验尝试探究光质对固定化小球藻的影响。

1 实验材料和方法

1.1 试剂与仪器 电子天平、分光光度计、手提电脑、溶解氧传感器、3 W LED 灯泡（白光和黄红光）、酒精灯、10 mL 一次性注射器、纱布、海藻酸钠、氯化钙、柠檬酸三钠、蒸馏水等。

1.2 藻种及培养 实验所用藻种从校内池塘采集后经微生物纯化培养所得， 采用BG-11 培养基进行培养，其组成为（1 000 mL）：NaNO31.5 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·7H2O 0.036 g、Na2CO30.02 g、柠檬酸0.006 g、柠檬酸铁0.006 g、微量元素溶液A5 1 mL、氨苄青霉素（终浓度）50 μg／mL、蒸馏水补充至1 000 mL 。

培养条件为（25±1）℃、光照强度为5 000 lx、连续光照。

1.3 小球藻的固定方法 目前最常用的小球藻固定方法是海藻酸钙包埋法， 将海藻酸钠加热融化后用注射器缓慢滴入到配制好的氯化钙溶液中，立刻成为凝胶颗粒状的海藻酸钙，固定化胶球的直径约为3.5 mm。

1.4 测量方法 小球藻生物量采用在680 nm 下用分光光度计测量其吸光值， 通过吸光值判断小球藻的生物量［3］。

小球藻溶解氧采用溶解氧传感器进行测量，探头的膜接触样品时，样品要保持一定的流速，防止与膜接触的瞬间将该部位样品中的溶解氧耗尽， 因此， 测量的时候需要不断摇动探头或者溶液，待读数不再上升时记录数据。

2 实验步骤

1）将处于对数生长期的小球藻液充分摇匀后取8 mL，平均分为2 份，A 份和B 份。

2）取A 份的小球藻液+ 26 mL BG-11 培养液+0.6 g 海藻酸钠配制成30 mL 2%海藻酸钠凝胶，用10 mL 注射器将凝胶缓慢（1 s/滴）滴入0.15 mol／L的氯化钙溶液中，形成直径3.5 mm 的藻球，摇动15 min 后，滤去氯化钙溶液，加蒸馏水润洗3 遍［4］。将藻球平分为4 份（每份200 颗），分别加入装有50 mL BG-11 培养液的锥形瓶中， 并用封口膜封口，分别标为A1、A2、A3、A4。

3）取B 份的小球藻液摇匀，平均分为4 份，各加入分别装有50 mL 的BG-11 培养液的锥形瓶中，并用封口膜封口，分别标为B1、B2、B3、B4。

4）将A1、A2、B1、B2 置于3 W LED 白光灯下连续光照培养， 将A3、A4、B3、B4 置于3 W LED黄红光灯下连续光照培养。

5）连续培养72 h。 每隔12 h，用手持技术溶解氧传感器测量A2、B2、A4、B4 中的溶解氧，并记录。

6）分别从A1、A3 瓶中取出20 颗固定化小球藻球，各加入装有10 mL 0.1 mol／L 的柠檬酸钠溶液中［5］，摇荡，直至藻球完全 融化（约 需50 min）。将融化后的藻液分别在分光光度计中测量吸光值（OD 680），并记录；将B1、B3 摇匀，各取2 mL 藻液测定吸光值（OD 680），并记录。

3 实验结果与讨论

3.1 固定载体对小球藻生物量的影响 本研究采用分光光度法测量吸光度间接衡量小球藻的生物量。结果发现，海藻酸钙凝胶小球将藻细胞固定起来，藻细胞的增殖被制约，藻细胞的增殖数量明显比悬浮态的小球藻生物量低（图1），白光培养下，B1 明显大于A1，B3 明显大于A3。对小球藻的生物量的测定还可以采用显微计数法进行测量，后续实验可增加显微计数的过程， 以进一步印证吸光度的结果。

图1 不同光质对小球藻生物量的影响

3.2 光质对小球藻生物量的影响 小球藻增殖所需能量来源于其光合作用。 小球藻细胞叶绿体的色素对不同的光质的吸收存在差异， 表现为白光条件下有利于其生物量的增加， 不过其增加并不显著， 这可能与小球藻吸收的光质较多是黄红光有关。 如图1，B1 和B3 在不同光质光照下，悬浮液培养的小球藻生物量并无存在显著差异；A1和A3 在不同光质光照下， 固定化培养的小球藻生物量也不存在显著差异。

3.3 固定载体对小球藻溶解氧产生的影响 小球藻能应用于水产养殖等主要是因为其进行光合作用产生氧气，增加鱼塘的溶解氧，同时为动物提供优质的食物。 实验结果显示，固定载体虽然制约了小球藻生物量的增长，但是其对水中溶解氧的供应与悬浮液培养的相比，几乎相等甚至更多（图2），白光条件下的固定化小球藻其产氧量最多。这可能与凝胶小球内部多孔，具有四通八达的网络结构有关，固定化的小球藻光合作用产生的氧气及时扩散到凝胶球外面的溶液中，提高光合作用的效率。

3.4 光质对小球藻溶解氧产生的影响 图2 的实验结果显示，白光和黄红光条件下，小球藻的产氧量并没有明显差异， 这进一步印证小球藻对可见光的利用可能主要是黄红光。 这为小球藻的培养条件提供了有益的参考。

图2 不同光质对小球藻溶解氧产生的影响

4 结论

实验结果显示， 不同光质对小球藻生物量有一定影响， 黄红光可能是小球藻光合作用利用的主要光质。 固定化载体对小球藻的生物量增长存在制约， 其生物量明显低于悬浮液培养条件下的小球藻。 固定化小球藻的光合速率明显高于悬浮液培养的小球藻光合速率， 这为固定化小球藻用于水产养殖、污水处理等提供了有益的参考。

5 反思

《普通高中生物学课程标准（2017年版）》提出“组织以探究为特点的主动学习是落实生物学学科核心素养的关键”的教学建议，提出教师应该提供更多的机会让学生亲自参与和实践，重视信息化环境下的学习，落实科学、技术和社会（STS）相互关系，培养学生的创新精神和实践能力［6］。 本探究创造性地将进行光合作用的小球藻利用固定化技术固定起来进行实验探究，取得良好的实验效果。

传统探究环境因素对光合作用强度的影响多采用定性的方式进行研究， 本实验利用传感器和分光光度计等数字化工具， 实现中学生物学探究实验的定量研究。 利用手持技术（传感器）等进行定量研究有力地激发了学生进行科学探究的积极性［7］。 同时，固定化细胞由于可以多次重复使用，简化了游离细胞需不断培养菌体的繁复操作，减少营养基质的浪费。基于关注社会，指导学生利用已有科学文化知识开展力所能及的探究很有必要，学生感受到学以致用，可激发学生进一步探究学习的兴趣。