结直肠癌Ang-2和CD147的水平及其对预后的预测价值

丛玲华 钟国平 陈 鲧 方来福 李 萍

手术及术后辅助化疗是结直肠癌患者的主要治疗方式，手术标本的病理检查及病理相关指标检测在结直肠癌患者的预后评估中有重要地位[1]。研究表明，Ang-2是一种新型的血管生成调节剂，在肿瘤血管生成中起着至关重要的作用，CD147通过调节肿瘤细胞与间质相互作用参与肿瘤的发生、发展和侵袭转移[2，3]。这两种标志物在肿瘤中的表达模式对肿瘤患者的预后可能有重要提示作用。为此，笔者医院通过组织芯片技术对260例结直肠癌患者进行研究，旨在探讨Ang-2和CD147在人结直肠癌中的表达水平及其对预后的预测价值，现报道如下。

资料与方法

1.临床资料:回顾性分析2012年6月～2016年5月笔者医院诊治的结直肠癌患者，纳入标准：①临床及病理检查符合《中国结直肠癌诊疗规范(2017版)》中结直肠癌的诊断；②均于笔者医院行结直肠癌根治术治疗及术后辅助化疗；③新发患者，无前期治疗干扰。排除标准：①无法耐受相关治疗而中途终止治疗的患者；②患者依从性较差，无法配合随访工作[4]。共纳入260例患者，其中，男性139例，女性121例，患者年龄58～75岁，平均年龄66.40±8.50岁，结肠癌113例，直肠癌147例。根据12个月内的预后情况，将结直肠癌患者分为生存组(215例)和死亡组(45例)，并选择50例结直肠息肉患者作为对照组，男性28例，女性22例，平均年龄65.63±8.91岁，结肠息肉43例，直肠息肉7例。

2.治疗方案：参照《中国结直肠癌诊疗规范(2017版)》指南，预后分期为临床Ⅰ期的患者行单纯手术治疗，临床Ⅱ～Ⅳ期期患者手术后分别联合单纯氟尿嘧啶类、5氟尿嘧啶为基础的铂类及铂类化疗联合贝伐珠单克隆抗体等靶向治疗[4]。

3.研究方法：通过组织芯片技术及免疫组化方法检测结直肠癌患者及对照组的Ang-2蛋白和CD 147蛋白表达水平。(1)组织芯片制备：由高年资病理医师重判每例的HE切片，在结直肠癌病例的癌组织、结肠息肉的息肉组织和两者周围正常组织各取3个区域，取样针直径1.5mm，设计7×6点阵，共42位点，组织芯间距3.0mm。52℃恒温烤箱融蜡，4℃冰箱存放备用。(2)免疫组化检查：采用组织芯片系统(Quick-Ray,UT06,韩国UNITMA公司)进行分析。组织芯片切片经二甲苯脱蜡、乙醇脱二甲苯、水化。柠檬酸缓冲液(pH值为6.0)加热至98℃12 min行抗原修复，分别滴加一抗Ang-2抗体(EPR2891, 美国Abcam公司)和CD147抗体(ab78106,美国Abcam公司)，二抗为通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温或37℃孵育30min。染色情况由2名高年资病理病理医师分别评估。两种蛋白的表达模式为：Ang-2蛋白表达于细胞质，CD147蛋白表达于细胞膜。染色强度分值如下：0分(无染色)、1分(≤20%的肿瘤细胞出现微弱或中等阳性)、2分(>20%的肿瘤细胞出现微弱或中等阳性或<70%的肿瘤细胞出现完全阳性)、3分(≥70%肿瘤细胞出现中等或完全阳性)。阳性细胞百分比分值为：0分(无细胞阳性)、1分(<25%细胞阳性)、2分(25%～75%细胞阳性)和3分(>75%细胞阳性)，着色肿瘤细胞≥1%定义为阳性。最终染色评分由强度分值和阳性细胞百分比分值相乘而来。

4.评价指标：比较结直肠癌组与对照组患者的一般资料、Ang-2及CD147的表达差异，不同预后结直肠癌患者的一般资料、临床病理资料及Ang-2及CD147的表达差异，并比较Ang-2及CD147预测结直肠癌患者预后的诊断效能(包括诊断准确率、敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值等)。准确率=诊断符合人数/总例数×100%，敏感度=真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)×100%，特异性=真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100%，阳性预测值=真阳性人数/(真阳性人数+假阳性人数)×100%，阴性预测值=真阴性人数/(真阴性人数+假阴性人数)×100%。

5.随访：根据病案信息每3个月对患者进行一次随访，终点事件为全因死亡。随访时间为12个月，随访截止于2017年5月。

结 果

1.一般资料:结直肠癌组与对照组患者的年龄、性别、BMI和既往史之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

2.结直肠癌组与对照组Ang-2及CD147的表达：结直肠癌组患者Ang-2及CD147表达水平明显高于对照组(P=0.000)，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图1及表2。

表1 结直肠癌组与对照组一般资料的比较

图1 结直肠癌组与对照组Ang-2及CD147的表达情况A.结直肠癌组中肿瘤组织高表达Ang-2蛋白 (EnVision法，×100)；B.对照组中息肉组织低表达Ang-2蛋白(EnVision法，×100);C.结直肠癌中肿瘤组织高表达CD147蛋白(EnVision法，×200)；D.对照组中息肉组织低表达CD147蛋白(EnVision法，×200)

3.不同预后的结直肠癌患者一般资料的比较：生存组与死亡组患者的年龄、性别、BMI和既往史之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表2 结直肠癌组与对照组Ang-2及CD147的表达情况

表3 不同预后的结直肠癌患者一般资料的比较

4.不同预后的结直肠癌患者临床及病理资料的比较：生存组与死亡组患者的肿瘤部位、病理类型、分化程度、临床分期及治疗方式等资料间比较差异无统计学意义(P>0.05)。生存组Ang-2及CD147表达分值明显低于死亡组(P=0.000)，淋巴结转移情况明显低于死亡组(P=0.000)，详见表4。

5.结直肠癌组织Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的ROC曲线:ROC曲线显示，应用Ang-2及CD147表达水平对预测结直肠癌患者预后具有较高的诊断效能，其AUC分别为0.821和0.788，差异无统计学意义(P>0.05)；Youden指数提示Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的最佳截点分别为≥4分和≥3分，详见图2和表5。

6.Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的诊断效能:应用ROC曲线所得出的最佳截点，Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的诊断准确率(81.88%，83.33%)、敏感度(81.30%，82.00%)、特异性(83.33%，87.69%)和阳性预测值(87.23%，89.23%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表6。

讨 论

结直肠癌发生率逐渐上升，发病年龄日趋年轻化，严重威胁人类健康[5]。虽然手术切除是治疗结直肠癌的主要方式，但患者术后的预后千差万别[6]。因此，寻找对肿瘤患者预后有意义的检测指标对预测结直肠癌患者预后及采取治疗措施迫切需要。随着病理技术的飞速发展，病理检测在肿瘤患者的治疗方式选择和预后评估中占据着越来越重要的位置，通过病理学技术进行肿瘤标志物的检测成为临床医生关注病情发展、采取治疗措施必不可少的组成部分[7]。尤其是组织芯片技术的开展，使得病理工作及科学研究得以大规模、标准化开展，为肿瘤相关标志物的研究提供了高效可行的技术平台。

表4 不同预后的结直肠癌者临床及病理资料的比较

图2 Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的ROC曲线

表5 Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的曲线下面积

指标最佳截点AUC标准误差95% CIAng-240.8210.05650.712～0.903CD14730.7880.06960.674～0.877

表6 Ang-2及CD147表达水平预测结直肠癌患者预后的诊断效能(%)

Ang-2是继血管内皮生长因子之后发现的一种新的促血管生成因子，它具有内皮细胞特异性，能够调节血管生成，在肿瘤血管形成中起到重要调节作用，不仅能够为肿瘤细胞提供快速生长所需的充足营养，还通过刺激相关细胞因子释放促进肿瘤细胞的增殖和生长，在肿瘤进展和不良预后中有重要促进作用[8，9]。CD147是一类细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)，通过刺激基质金属蛋白酶(MMPs)的生成进而增加细胞外基质和基膜的降解，为肿瘤的侵袭和转移提供充分条件[10，11]。可见，这两种标志物在肿瘤患者疾病进展和不良预后中都有重要的促进作用。

本研究通过对2012～2016年260例结直肠癌患者进行回顾性分析，结果显示，结直肠癌组与对照组患者的年龄、性别、BMI和既往史之间差异无统计学意义，但结直肠癌组患者Ang-2及CD147的表达水平明显高于对照组，提示结直肠癌具有较高的Ang-2及CD147表达水平。肿瘤细胞增殖和转移的一个重要条件是肿瘤血管形成，Ang-2破坏内皮细胞和周围基质，增加不稳定状态的血管内皮和基质对生长因子的敏感度，诱导血管再建和肿瘤血管生成，为肿瘤细胞增殖提供保障[12，13]。细胞外基质对肿瘤细胞的迁移有阻碍作用，CD147通过MMPs，尤其是MMP-2降解细胞外基质，减少肿瘤侵袭和转移的天然阻力[14]。由于Ang-2和CD147两种标志物都在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移中扮演重要角色，因此在结直肠癌中的表达水平明显增高。Ismail等[3]和Hyungjoo[1]分别研究了CD147和Ang-2在结直肠癌患者中的表达情况，发现这两种标志物在结直肠癌患者中明显增加，与本研究结论一致。

此外，生存组与死亡组患者的一般资料(年龄、性别、BMI和既往史)及肿瘤部位、病理类型、分化程度、临床分期及治疗方式等资料间比较，差异无统计学意义，但生存组Ang-2及CD147表达分值明显低于死亡组，淋巴结转移情况明显低于死亡组，提示Ang-2及CD147在不良预后患者中表达明显增加，淋巴结转移在不良预后患者中明显增多。同时，ROC曲线显示，应用Ang-2及CD147表达水平对预测结直肠癌患者不良预后具有较高的诊断效能，最佳截点分别为≥4分和≥3分，但Ang-2及CD147的诊断准确率、敏感度、特异性和阳性预测值比较差异无统计学意义。其原因为Ang-2的主要作用是促进肿瘤血管生成，新生的肿瘤血管不仅是肿瘤细胞增殖所必需的内部条件，也是肿瘤侵袭和转移的第一路径[15, 16]。CD147主要通过活化 MMP-2降解基膜和细胞外间质，促进肿瘤的侵袭和转移，而MMP-2在发挥作用过程中，还可以释放促血管生成因子，尤其是血管内皮生长因子(VEGF)，从而促进新生血管形成，与Ang-2具有协同作用。同时，淋巴结转移为肿瘤细胞的全身播散提供了必要的途径，是肿瘤患者病情进展的标志之一，通过Ang-2的促肿瘤血管生成及CD147的细胞外间质讲解作用，肿瘤细胞获得更多侵袭血管和淋巴管的机会，大大增加了淋巴结的转移机会。因此，Ang-2、CD147及淋巴结转移三者在结直肠癌演变和进展中即各自发挥特定作用，又在时间和空间上相互配合，协同促进细胞癌变的发生、发展和侵袭转移。这与Salem等[17]和Farahani等[18]的研究结果一致。但由于本研究的免疫组化结果采用半定量分析方法，有一定主观性，其准确度、敏感度和特异性尚存在一定误差，因此有待于进一步研究。

综上所述，结直肠癌患者Ang-2和CD147表达水平较高，Ang-2和CD147在预测结直肠癌患者预后中有较高价值，Ang-2≥4分和CD147≥3分可作为提示不良预后的参考指标。