适于生活废水中快速生长的微藻筛选及其培养条件优化

张 波， 崔梦瑶， 张安龙， 刘少卓， 侯银萍， 王先宝

(陕西科技大学 环境科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

随着全球经济的快速发展，人类对能源的需求日益增加.传统石化能源不断耗竭导致的能源危机以及环境污染问题已经成为遏制世界发展的瓶颈.因此，对可再生、环保替代能源的开发研究十分迫切.微藻被认为是最具应用前景的可再生生物资源之一，它是一类在海洋和陆地都广泛分布的单细胞生物，具有光合效率高、生长周期短、易于大规模培养的特点[1,2]；微藻还具有吸收CO2的能力，并且可以利用各类废水中N、P等营养进行生物量的积累.有研究表明，部分微藻含油量可高达干重的50%以上[3]，但目前过高的微藻生物柴油生产成本限制了其发展[4-6].

微藻培养成本占据微藻生物柴油制备总成本的70%，如何降低微藻的培养成本已经成为微藻生物柴油产业化应用的关键所在[7].对于这一问题，目前可行的解决办法是利用废水培养微藻.生活废水具有排放量大，N、P含量高，成分复杂等特点.微藻细胞通过光合作用进行生长的同时可以吸收水体中的N、P元素，并使之转化为蛋白质、脂肪酸等细胞组分[8,9].以生活废水培养微藻，为同时实现废水的无害化处理、资源化利用以及降低微藻培养成本提供了可能，从而将废水水质净化与生物质生产相结合，实现废水由处理工艺向生产工艺的转变.

这一工艺目前还存在着生物量产率低和藻种资源有限的问题.因此筛选抗污能力好、废水环境适应性强的微藻藻种对废水培养微藻体系的建立至关重要.本研究拟针对陕西科技大学周边不同水域环境进行微藻的分离筛选，以期获得可在生活废水中快速生长的藻种，并考察其在生活废水中生物量积累的能力和N、P营养的去除能力，并通过Box-Behnken响应面试验设计对目标微藻在混养生长过程中所需的碳源、氮源、磷源浓度进行优化，以获得其最佳培养条件.本研究的目的在于筛选出适合在废水中培养的微藻，提高其生物质产量并降低培养成本.

1 试验部分

1.1 主要试剂和仪器

(1)主要试剂：硝酸钠，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；磷酸氢二钾，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；葡萄糖，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司.

(2)主要仪器：QGZ-500A智能光照培养箱，杭州琦胜科技有限公司；ZHWY-100B经典型多振幅轨道摇床，上海珂淮仪器有限公司；OPTIMA XPN-10型低温超速离心机，美国贝克曼库尔特公司；Cary 5000型紫外-可见-近红外分光光度计，美国安捷伦公司.

1.2 微藻分离纯化

本研究对陕西科技大学人工湖、陕西科技大学污水处理站进水口、陕西科技大学前街污水沟、西安工业大学人工湖、西安未央湖、西安第五污水处理厂生物处理单元等地进行水样采集，用3层纱布过滤除去水样中大型浮游生物及悬浮颗粒.对取回实验室的水样进行镜检，若发现水中藻类数量较多，可立即直接分离；若发现藻类数量较少，应向样品中加入1/2浓度的BG11[10]培养基进行富集培养，待藻类增多后再行分离.取适量水样加在血球计数板上，镜检计数水样中藻类的密度，按照每个平板50～200个藻类细胞浓度对水样进行稀释.取适当浓度的水样100μL均匀涂布于平板上，置于光照培养箱中，待平板长出清晰绿色的藻落后，挑取单藻落在新的平板上划线，镜检确定是否达到分离目的，重复划线直到获得纯种微藻藻种.

进行水质分析时，将废水液体样本3 000 rpm 离心10 min后收集上清液，并适当稀释后参照《水和废水监测分析方法(第4版)》[11].总氮和总磷浓度的检测分别采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[12]与钼酸铵分光光度法[13]进行分析.COD的含量采用连华科技多参数水质测定仪5B-6C测定.水质分析结果如表1所示.

1.3 微藻培养

将接种有微藻的平板放在光照培养箱中静置培养，三角瓶藻液置于光照下进行摇床振荡培养.摇床转速为150 rpm，光暗时间比为14∶10，温度与光照强度分别设定为28 ℃和3 500 lux.

1.4 微藻生长的测定

离心(5 000 rpm,10 min)收获微藻培养液，将藻泥置于冷冻干燥机中冻干，对获得的干藻粉称其质量，以单位体积干重表示其生物量(g/L).

以BG11培养基为参比测定样品在540 nm紫外光波长下的吸光值.

比生长速率(d-1)=(lnXt-lnX0)/t

(1)

式(1)中：X0为接种后的初始OD(540 nm)，Xt为培养t天后的OD(540 nm)[14].

1.5 生活废水培养微藻

用于微藻培养的废水收集于陕西科技大学前街生活废水排污口.将废水用3层纱布过滤除去水样中大型浮游生物及悬浮颗粒后，稀释2倍，再将微藻培养液接种，摇床振荡培养.摇床转速为150 rpm，光暗时间比为14∶10，温度与光照强度分别设定为28 ℃和3 500 lux.

1.6 Chlorella sp.营养条件的响应面优化

使用Design-Expert.V8.0.6.1中的Box-Behnken方法进行响应面设计，根据响应面设计结果进行试验，最终得到响应值，并进行方差分析及最优结果的预测.以培养基中葡萄糖、硝酸钠与磷酸氢二钾的浓度为优化因素，在前期单因素试验结果的基础上，分别设置三个水平值(表2)，使用Design-Expert.V8.0.6.1设计试验，得到不同因素水平配比的试验组合，试验全部设置三个平行对照组.根据此设计进行试验，采用葡萄糖、硝酸钠、磷酸氢二钾不同配比的培养基对Chlorellasp.进行培养，培养7天后，收集藻体，得到生物量，计算得出相应生物量积累速率即为响应面设计的试验响应值.

表2 试验因素及水平

2 结果与讨论

2.1 分离纯化所得微藻

本文从陕西科技大学人工湖、陕西科技大学污水处理站进水口、陕西科技大学前街污水沟、西安工业大学人工湖、西安未央湖、西安第五污水处理厂生物处理单元等水域采集水样10份，经分离纯化得到24株微藻藻株，其中12株可以利用葡萄糖进行异养生长.通过显微镜镜检观察，所得的藻株多属于小球藻(Chlorellasp.)、栅藻(Scenedesmussp.)，部分结果如图1所示.

(a)、(b)、(c)小球藻 (d)舟型藻 (e)衣藻 (f)、(g)、(h)、(i)栅藻图1 微藻的显微形态(放大400倍)

2.2 不同微藻比生长速率的比较

为了筛选获得在生活废水中生物量积累能力强的藻株，将12株可异养藻株接入生活废水中培养，以Chlorella1068为参照，比较其比生长速率，结果如图2所示.不同藻株在废水中的比生长速率差异较大，其中藻株H (经形态学初步鉴定为Chlorellasp.，其细胞形态如图1(b)所示)的比生长速率最高，达到0.17 d-1，生物量产率为109 mg/Ld.

图2 不同微藻在生活废水中比生长速率比较

2.3 废水中小球藻的生长与营养的去除

图3描述了藻株H (小球藻Chlorellasp.)在生活废水中的生长状况.整体而言，小球藻Chlorellasp.在生活废水中的生长状况与BG11中相似，接种前2天微藻生长相对缓慢，2～4天内进入对数生长阶段，培养末期生物量干重达到1.07 g/L，生物量产率为109 mg/Ld.与此同时，生活废水可得到良好的净化 (图4)，COD、TN、TP的去除率分别达到39%、88%和93%.

图3 小球藻Chlorella sp.在生活废水中的生长曲线

图4 小球藻Chlorella sp.对生活废水中COD、TN、TP的去除率

2.4 响应面结果分析

为了明确小球藻 (Chlorellasp.) 生物量积累的最佳营养条件，本文以BG11培养基为基础，利用响应面分析方法[15]优化了相关的三个主要营养因素：葡萄糖浓度、硝酸钠浓度和磷酸氢二钾浓度.表3显示了Box-Behnken设计中各因素不同水平下小球藻 (Chlorellasp.) 生物量产率的高低.以小球藻 (Chlorellasp.) 生物量产率为响应指标，利用Design-Expert.V8.0.6.1对结果进行二次多元回归拟合，得到响应值对编码自变量(葡萄糖浓度A、硝酸钠浓度B和磷酸氢二钾浓度C)的二元多次回归方程式如式(2)所示：

生物量积累速率=0.70+0.07 3A+0.024B+0.067C+0.035AB+0.072AC+0.001 86BC-0.11A2-0.15B2-0.11C2

(2)

通过表3中Run1与Run4数据对比分析可知，硝酸钠浓度的变化对小球藻(Chlorellasp.)的生长影响不大，与方差分析(ANOVA)中硝酸钠浓度对微藻的生物量产率影响不显著的结果吻合.Run13与Run17结果对比显示葡萄糖浓度对微藻生长影响较为明显，在硝酸钠浓度与磷酸氢二钾浓度一致时，在一定范围内随着葡萄糖浓度增大，微藻的生物量产率增大，表明在小球藻(Chlorellasp.)生长过程中，丰富的碳源对微藻产率至关重要.因此可以推断，在利用废水进行微藻培养的过程中，体系中有机物含量将对微藻产量与COD的降解产生重要影响.Run4与Run16结果显示当磷酸氢二钾浓度在一定范围时(0.01～0.05 g/L)，磷源浓度越大，微藻生物量产率越大，说明磷浓度的变化对微藻生物量产率有较大影响.

生物量积累速率(Y)回归诊断表明，R2为0.980 3，Adj R2为0.955 0，这说明实际值与预测值之间有较好的关联度.信噪比(Adeq Precision)大于4表明模型可用于预测，此处信噪比为14.853，这表明方程的拟合度与可信度均较高，试验误差较小，能够对培养基的优化进行预测与分析.

表3 实验设计及响应值

表4为模型方差分析结果，模型的显著性和各变量对响应值影响的显著性水平用F检验和P值来进行判定.概率P的值小于0.01表示影响极显著，小于0.05表示影响显著，大于0.05表示影响不显著.由表4可知，模型显著且模型失拟项不显著，说明检验结果与模型计算结果没有显著差异，生长影响较为明显，在硝酸钠浓度与磷酸氢二钾浓度一致时，一定范围内微藻的生物量产率随着葡萄糖浓度增大而增大.这表明小球藻 (Chlorellasp.) 生长过程中，丰富的碳源对微藻产率至关重要.因此可以推断，在利用废水进行微藻培养的过程中，体系中有机物含量将对微藻产量与COD的降解产生重要影响[16].Run4与Run16的结果显示建立的关于磷的回归模型显著，A、C、AC、A2、B2、C2对生物量产率的影响极为显著；其他项对生物量产率影响不显著.

表4 模型的方差分析

R2=0.980 3 AdjR2=0.955 0

三维响应面图可以用来直观地表达各因素之间的交互作用，并且可以找出最佳的响应值.利用Design-Expert.V8.0.6.1软件画出两个因素与生物量产率之间的响应面及等高线分析图，如图5所示.

在同一椭圆型的区域内，响应值是相同的.等高线图越密集，与其相对应的响应面的弧度变化率就越大，说明因素对响应值的影响越大；反之，等高线图越疏松，与其相对应的响应面的弧度变化率就越小，对应因素对响应值的影响越小[17].所以，在试验条件范围内对响应值影响最大的因素为葡萄糖，其次为磷酸氢二钾和硝酸钠.等高线的形状可反映出交互作用的强弱大小，椭圆形表示两因素的交互作用显著；而圆形则与之相反.由图5(c)可以看出等高线图呈明显椭圆形状，说明葡萄糖浓度和磷酸氢二钾浓度之间存在较大的交互作用.由图5(e)可以看出等高线呈圆形，说明硝酸钠与磷酸氢二钾交互作用较小.在响应面的基础上，根据Design-Expert.V8.0.6.1软件中的Optimization分析得出优化结果：以BG11为基础体系培养小球藻(Chlorellasp.)的最佳条件为6.81 g/L葡萄糖、0.52 g/L硝酸钠和0.04 g/L磷酸氢二钾，预测最大微藻生物量产率为0.737 g/Ld.为了检验模型的准确性，在预测最佳培养基配方条件下进行3次试验，得到微藻生物量产率为0.71±0.02 g/Ld，与模型预测相符，证明了模型预测的准确性.与优化前的BG11培养基中生长量 (0.13 g/Ld) 相比，优化后的微藻产率提高了4.5倍.

(a)葡萄糖浓度和硝酸钠浓度交互作用的等高线图

(b)葡萄糖浓度和硝酸钠浓度交互作用的响应面图

(c)葡萄糖浓度和磷酸氢二钾浓度交互作用的等高线图

(d)葡萄糖浓度和磷酸氢二钾浓度交互作用的响应面图

(e)硝酸钠浓度和磷酸氢二钾浓度交互作用的等高线图

(f)硝酸钠浓度和磷酸氢二钾浓度交互作用的响应面图图5 葡萄糖、硝酸钠和磷酸氢二钾浓度对小球藻(Chlorella sp.) 生物量积累速率的影响

3 结论

(1)研究发现，从陕西科技大学周边水域中分离出来的藻株H (小球藻Chlorellasp.) 比生长速率 (0.17 d-1)最高，其生物量产率可以达到109 mg/Ld，且小球藻Chlorellasp.对生活污水水质有着良好的处理效果，COD、TN、TP的去除率分别达到39%、88%和93%.

(2)在BG11培养基中，通过响应面Box-Behnken设计优化对小球藻Chlorellasp.生物量积累影响较大的三个因素，结果显示其最佳的浓度为：葡萄糖浓度6.81 g/L，硝酸钠浓度0.52 g/L和磷酸氢二钾浓度0.04 g/L.小球藻的最大生物量产率提高了4.5倍(0.71±0.02 g/Ld).