白花蛇舌草的简单重复序列区间(ISSR)遗传多样性分析

周 敏，高慧新，封 毅，曾昭清，田 慧

(广西中医药大学药学院，南宁 530002)

白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.是茜草科Rubiaceae耳草属Hedyotis植物，是壮族民间常用中草药，在《广西壮族自治区壮药质量标准》[1]和《中华人民共和国药典》[2]中均有收载，内服多用于治疗小儿疳积、胃痛、肝炎、肿瘤，外用治疗毒蛇咬伤，泡疮、刀伤、跌打等症。随着分子标记技术的快速发展，越来越多学者利用分子标记对物种遗传多样性进行研究。常见的分子标记有随机引物扩增DNA多态性(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragrment length polymorhism,AFLP)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)和简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记技术等。ISSR是由加拿大学者Zietkiewicz等[3]于1994年在PCR的基础上创建的分子标记技术。其原理为：在SSR的5′或3′端锚定2～4个随机碱基作为引物，引物能在特异位点退火。ISSR分子标记具有多态性高、重复高、稳定性好、操作方便及成本低等优点。近年来已有很多学者利用ISSR分子标记对物种的遗传多样性及其真伪鉴定[4-6]。基于此，本文研究将利用ISSR分子标记技术对采集不同省份共23份的白花蛇舌草进行遗传多样性研究，以期为白花蛇舌草的分类鉴定提供了理论依据。

1 样品采集

本研究共23份白花蛇舌草样品的采集分别来自广西壮族自治区、广东省、湖南省、浙江省、福建省、江西省和安徽省7个省区，样品采集后立刻装入含硅胶的密封袋中，并勤换硅胶，直至样品干燥完全。所采集的样品经广西中医药大学马雯芳副教授鉴定，为茜草科耳草属植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld。样品保存于广西中医药大学壮瑶药协同创新中心样品储存室-20 ℃冰箱，备用。样品采集信息见表1。

Table1HedyotisdiffusaWilld.samples for ISSR analysis

Sample numberCollecting locationCollecting time (Y/M/D)Population province1Yongning District,Nanning City2016/06/25Guangxi2Guangxi Medical Botanical Garden2016/07/09Guangxi3Qingxiu District,Nanning City2016/06/30Guangxi4Longsheng County,Guilin City2016/10/05Guangxi5Rong'an County,Liuzhou City2016/05/25Guangxi6Rongshui County,Liuzhou City2016/06/20Guangxi7Qinbei District,Qinzhou City2016/06/30Guangxi8Fangcheng Port District,Fangchenggang City2016/03/23Guangxi9Pingnan District,Guigang City2016/06/15Guangxi10Xingye County,Yulin City2016/06/12Guangxi11Jingxi County,Baise City2016/06/09Guangxi12Zhaoping District,Hezhou City2016/06/10Guangxi13Zengcheng District,Guangzhou City2016/06/15Guangdong14Gaozhou City,Maoming City2016/06/14Guangdong15Ruian City,Wenzhou City2016/06/15Zhejiang16Wanli District,Nanchang City2016/07/06Jiangxi17Xianju County,Taizhou City2016/07/12Zhejiang18Xiuning County,Huangshan City2016/07/14Anhui19Nankang District,Zhangzhou City2016/07/23Jiangxi20Anren County,Chenzhou City2016/06/16Hunan21Huayao County,Yongzhou City2016/07/08Hunan22Tong'an District,Xiamen City2016/07/06Fujian23Gutian County,Ningde City2016/07/06Fujian

2 材 料

2.1 试 剂

DNA提取试剂盒、RNase、D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；GelRed染料(美国Biotium 公司)；琼脂糖(美国英杰生命技术有限公司)。

2.2 仪 器

高速冷冻离心机(德国赛默飞世尔公司)；手掌型离心机(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；梯度PCR仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像仪(美国Gel Logic公司)；超纯水一体机(美国Millipore公司)。

3 方 法

3.1 DNA的提取

对所有样品进行总DNA的提取，方法依照按照天根植物总DNA提取试剂盒操作步骤，将提取的总DNA分装至-20 ℃保存备用。

3.2 引物的合成与筛选

实验所用150条引物，其中100条来自哥伦比亚大学(UBC)公布的通用引物，其余50条自设引物，根据ISSR引物设计原则：2～3个碱基简单重复4～5次，一端或者两端加2～4个锚定碱基。自设引物序列如表3。引物均由华大基因公司合成。用23份白花蛇舌草样品对150条ISSR引物进行扩增筛选，PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并筛选出背景清晰、扩增效果好和多态性高的引物用于ISSR-PCR反应；同时根据各个引物的Tm，对各个引物的最佳退火温度进行筛选。

Table2 Self-designed primer sequence used for the ISSR amplification

PrimerPrimer sequences (5'→3')PrimerPrimer sequences (5'→3')117ATATATATATATAC162CGCCGCCGCCGCCGCTC118ATATATATATATCG169CTCTCTCTCTCTTG119GTGTGTGTGTGTGC170CTCTCTCTCTCTAC120GTGTGTGTGTGTGCC171CTCTCTCTCTCTGC121ACACACACACACTC172CACACACACACACACATC122ACACACACACACTCT173CACACACACACAAT123ACACACACACACTG174CACACACACACAAG124ACACACACACACTGG175CACACACACACAGC125CTCTCTCTCTCTAG182GTGGTGGTGGTGGTGAC126CTCTCTCTCTCTAGA183GTGGTGGTGGTGGTGAT127ATAATAATAATATC184GTGGTGGTGGTGGTGAG128ATAATAATAATATCA185GTGGTGGTGGTGGTGCT129ATAATAATAATACT186GTGGTGGTGGTGGTGTG130ATAATAATAATAATACG187GTGGTGGTGGTGGTGCG131CTCATCATCATCATCTA101ACACACACACACCGC132CTACTACTACTACTAAC102ACACACACACACCGG133TATTATTATTATTATTA103ACACACACACACCGA146GTCGTCGTCGTCGC104ACACACACACACCGT148TGTGTGTGTGTGCT105ATATATATATATACA150CACACACACACACT106ATATATATATATACT151ACACACACACACGT107GTGTGTGTGTGTGCG156ACACACACACACCT108GTGTGTGTGTGTGCC157ACACACACACACCG109TGTGTGTGTGTGCTA160GATGATGATGATGC110TGTGTGTGTGTGCTG161CGCCGCCGCCGCTG111CTCTCTCTCTCTAGA

3.3 PCR扩增

ISSR-PCR反应体系设置为：PCR反应体系的体积为20 μL，2×TaqPCR Mastermix 10 μL，正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。ISSR-PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火30 s(不同引物Tm决定)，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

3.4 电泳检测

取PCR产物8 μL用1.2%的琼脂糖凝胶(含GelRed染料)电泳，电压75 V，电泳50 min，用D2000 DNA Marker作为标准参照。电泳结束后，在紫外凝胶成像仪中观察并拍照保存。

3.5 数据统计

ISSR为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为是同一位点的产物[7]。对凝胶电泳图进行分析，同一位点有相同的扩增条带记为“1”，无则记为“0”，从而得到“1”、“0”矩阵图[8]。采用POPGENE1.32、NTSYS2.10软件对白花蛇舌草的ISSR-PCR数据进行归类和分析。利用POPGENE1.32计算有效等位基因(Ne)、等位基因数(Na)、Shannon′s信息指数(I)、Nei′s基因多样性指数(H)等遗传多样性参数，以及居群内基因多样性(Hs)、居群总基因多样度(Ht)、居群间遗传分化系数(Gst)以及基因流(Nm)等遗传分化指标。其中Ne值越大，说明等位基因越重要，等位基因作用越大。I和H越大，说明该样品遗传多样性水平越高。最后利用NTSYS2.10软件做聚类分析图。

4 结 果

4.1 引物的筛选

本实验从150条引物中筛选出11条重复性好、条带清晰且多态性高的引物，其中从通用引物筛选出7条，自设引物筛选出4条，可用于白花蛇舌草遗传多样性分析。为取得较好的实验结果，本研究对已筛选的11条引物的退火温度进行优化，各个引物的序列及筛选出的最佳退火温度如表3，部分扩增图见图1。

4.2 不同产地的白花蛇舌草遗传多样性分析

由表4可知，广西产白花蛇舌草的Ne、H和I均最大，分别为1.535 5、0.300 2和0.438 1，说明广西产白花蛇舌草等位基因作用最大、遗传多样性最高。由整体样本的物种水平可知，白花蛇舌草的Na为1.852 2，Ne为1.543 4，H为0.316 5，I为0.470 0。

Table3 Primers used for the inter simple sequence repeat (ISSR) amplification,and its annealing temperature and number of the amplified bands

PrimerPrimer sequence (5'→3')Annealing temperature/℃Amplified number of bandsNumber of polymorphic bandsProportion of polymorphic bands(PPB)/%UBC825ACA CAC ACA CAC ACA CT48.999100.00UBC826ACA CAC ACA CAC ACA CC51.29777.78UBC827ACA CAC ACA CAC ACA CG46.98562.50UBC842GAGAGAGAG AGA GAG AYG50.3131184.61UBC856ACA CAC ACA CAC ACA CYA51.58787.50UBC881GGG TGG GGT GGG GTG53.2141392.86UBC885BHB GAG AGA GAG AGA GA52.69555.56121ACACACACACACTC51.6141392.86156ACACACACACACCT48.9131292.30157ACACACACACACCG52.610990.00160GATGATGATGATGC54.28787.50

Figure1 PCR amplification electrophoresis of primer 157.M represent marker.The sample number 1-23 were shown in Table 1

Table4 Genetic diversity coefficients of the Hedyotis diffusa Willd.populations

PopulationNumber of alleles (Na)Number of effective alleles (Ne)Nei's index (H)Shannon's index (I)Number of polymorphic bandsProportion of polymorphic bandsGuangxi1.756 51.535 50.300 20.438 18775.65Guangdong1.304 31.215 20.126 10.184 03530.43Zhejiang1.234 81.166 00.097 30.142 02723.48Jiangxi1.304 31.215 20.126 10.184 03530.43Anhui1.000 01.000 00.000 00.000 000Hunan1.139 11.098 40.057 60.084 11613.91Fujian1.147 81.104 50.061 20.089 41714.78Species level1.852 21.543 40.316 50.470 09885.22

4.3 白花蛇舌草遗传分化的分析

采用POPGENE1.32软件对不同省份的白花蛇舌草进行遗传分化分析，结果见表5，不同产地白花蛇舌草的居群总基因多样度(Ht)为0.289 6，居群内基因多样性(Hs)为0.109 8，居群间遗传分化系数(Gst)为0.620 9。其中Gst>Hs，说明居群间遗传分化度比居群内遗传分化度更高。基因流(Nm)为0.305 2<1，说明居群间遗传分化水平较低，不同产地居群间基因交流较少。

Table5 Coefficients of the genetic diversity and gene flow within and among theHedyotisdiffusaWilld.populations

Total Sample number Total genetic diversity among populations(Ht)Genetic diversitywithin a population(Hs)Genetic Diversity index among populations(Gst)Gene flow among populations (Nm)230.289 60.109 80.620 90.305 2

4.4 白花蛇舌草遗传距离的分析

采用POPGENE1.32软件对不同省份的白花蛇舌草的遗传距离进行分析，白花蛇舌草的Nei′s遗传相似度和Nei′s遗传距离，由表6可知。7个不同省份的白花蛇舌草遗传相似度在0.668 3～0.852 2，遗传距离在0.160 0～0.403 0，说明7个不同省份的白花蛇舌草遗传相似度较高，遗传距离较近；其中，浙江和广西的遗传相似度为0.852 2，遗传相似度最高；安徽和福建的遗传相似度为0.668 3，遗传相似度最低。浙江和广西的遗传距离为0.160 0，遗传距离最小；安徽和福建的遗传距离为0.403 0，遗传距离最大。

Table6 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among differentHedyotisdiffusaWilld.populations

PopulationGuangxiGuangdongZhejiangJiangxiAnhuiHunanFujianGuangxi/0.813 00.852 20.845 30.765 60.817 20.777 4Guangdong0.207 0/0.775 40.753 40.728 30.724 10.729 9Zhejiang0.160 00.254 4/0.816 20.701 40.806 70.801 6Jiangxi0.168 00.283 20.203 1/0.802 70.791 80.722 6Anhui0.267 10.317 10.354 70.219 8/0.671 80.668 3Hunan0.201 80.322 90.214 80.233 40.397 8/0.784 1Fujian0.251 80.314 80.221 20.324 90.403 00.243 3/

4.5 不同产地白花蛇舌草的NTSYS聚类分析

采用NTSYS2.10软件对23份不同产地的白花蛇舌草进行聚类分析，见图2。遗传相似度在0.68(Ⅰ)，可将白花蛇舌草分成3大类：第1类包括19份样品，多为广西壮族自治区样品；第2类为柳州融水，第3类包括3份样品，来自广东茂名、安徽黄山和江西南昌。遗传相似度在0.73(Ⅱ)，可将第1类分为4个亚类，第1亚类包括广西中医药大学、江西南昌、浙江台州、广西桂林和柳州融安共5份样品；第2亚类包括广西钦州、防城港、贵港、玉林、玉林、贺州，广东茂名和浙江温州共8份样品；第3亚类包括广西药用植物园和广西青秀区2份样品。第4亚类包括湖南郴州、永州和福建厦门、宁德共4份样品。第3类分为2个亚类，广东广州归为一类，安徽黄山和江西赣州归为另一类。由上可知，广西壮族自治区样品大部分聚在一起，湖南和福建的样品聚在一起；钦州样品和防城港市样品亲缘关系最近，可能因为地理位置相毗邻，故遗传距离较近，说明大部分的样品的遗传多样性和地理位置有关。柳州融水的样品与其它广西地区的样品亲缘关系最远，可能是因为融水采集的样品在偏远山区，与其它的样品无法进行基因交流；广东茂名的样品与广西壮族自治区样品聚在一类，未与广东广州样品聚在一类，可能是因为广东茂名离广西地理位置相近，气候等与广西相近，与广西样品基因交流多；江西南昌与浙江台州样品与广西产白花蛇舌草聚在一类，可能是因为二者皆采自旱地，叶片偏革质，与广西采样品性状相近。

5 讨 论

物种的遗传多样性决定物种对环境的适应能力和进化程度，遗传多样性越丰富有利于物种适应新环境及扩展分布范围。白花蛇舌草在中国分部范围较广，《中国植物志》记载[9]，产于广东、广西、海南、安徽、云南等地，多见于水田、田埂和湿润的旷地。采集样品时发现，田间等湿润地方采集的白花蛇舌草多柔韧，叶子更宽，易掐断；山坡及向阳处采集的白花蛇舌草多偏革质。形态变异的本质是基因的变异，不同地区的白花蛇舌草形态不尽相同，本研究通过ISSR分子标记对不同产地的白花蛇舌草进行分析得，白花蛇舌草遗传分化水平较高，对不同的环境适应能力较强。影响物种遗传变异的主要因素有：分布范围、分类地位、种子散播机制、繁育系统及生活型，而在种群水平上重要性变为:繁育系统、分布范围、生活型、分类地位和种子散播机制[10]。本研究白花蛇舌草居群间遗传分化度比居群内遗传分化度更高。可能是因为白花蛇舌草成片生长，居群内基因交流较多，而居群间采样地域跨度大，有的在山区，有的在沿海，风媒传播及虫媒传播无法进行，使得居群间交流少。本研究结果表明，ISSR分子标记可以为白花蛇舌草的系统分类和鉴定提供了分子水平的理论依据。

Figure2 UPGMA dengrogram of theHedyotisdiffusaWilld.populations