木霉T6和青霉K菌株混合培养的溶磷促生效应

任季平，李发康，丁有来，王 雪，薛应钰

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不仅数量巨大，而且种类极多，许多微生物对土壤氮，磷和钾等养分的转化和供给起非常重要的作用[1]。木霉(Trichodermaspp．)和青霉(Penicilliumspp．)是土壤中广泛存在的丝状真菌，由于其具有防病、促生和解磷等多种功能，在生产上已经广泛应用。张曼曼等[2]从土壤中分离筛选到5株具有很好解磷能力的木霉菌株，其中木霉T-404的解磷效果最好，为109.22 mg/L。也有研究表明，哈茨木霉(T．hatzianum)和康宁木霉(T．koningii)能够显著提高马铃薯、烟草和红萝卜的发芽率，出苗率及干重[3]，长枝木霉T6 菌株(T．longibrachiatum)分生孢子悬浮液能够显著提高3种禾本科和3种豆科牧草幼苗的生长和相关生理效应酶的活性[4]。淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)杀线活性与化学杀线剂相比无明显差别，甚至超过化学杀线剂[5]，该菌可寄生一些植物线虫的卵、幼虫及成虫，对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)的卵寄生率高达60%～70%[6-7]。因此，木霉和青霉是理想的生物肥料菌种。

微生物之间存在着协同、竞争、拮抗、捕食等作用。早在1925年就有学者发现不同菌株组合混合培养可以形成不同的产物。研究认为混合培养能减少或避免纯培养过程中生物活性下降的现象，增加培养菌生物量，获得更多的菌株性质[8]。韩梅等[9]对根瘤菌S-2、溶磷菌P-3和硅酸盐细菌K-5共3株菌进行两两复合及三菌复合培养，发现两两复合培养的溶磷能力比各菌单独培养溶磷能力要提高25.50%，51.54%和26.99%，并且三菌复合培养溶磷效果提高最显著；韩梅等[10]报道溶磷菌GY+硅酸盐细菌JY组合较单个菌株GY、JY单独培养解磷量增加了77%和52%。微生物之间存在的协同作用是一个潜能巨大的新的微生物资源，正在逐渐成为新的研究热点。

木霉T6和青霉K菌株是甘肃农业大学植物病原学实验室分离并保存的具有防病、溶磷和促生等多功能菌株。前期研究表明，以Ca3(PO4)2为唯一磷源，木霉T6菌株15 d的解磷量为90.01 μg/mL，对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑制率分别达89.46%和94.11%[11]；以木霉T6和青霉K菌株为供试材料，研究其单独培养和混合培养后发酵液的解磷和促生能力，旨在扩大两种菌株的生物功能，为后期二者相关生物制剂的研制提供重要的理论依据，也为复合微生物肥料的开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 木霉(Trichodermasp.)T6菌株与青霉(Penicilliumsp.)K菌株，由甘肃农业大学植物病理学实验室提供。

1.1.2 供试种子 小麦种子西农979和白菜种子春鸣均购买于甘肃省农业科学院。

1.1.3 培养基 马铃薯琼脂培养基(PDA)：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL[3]。

解磷培养基(NBRIP)[12]：(NH4)2SO40.5 g ，NaCl 0.3 g，FeSO40.03 g，MnSO40.03 g，KCl 0.3 g，MgSO4.7H2O 0.3 g，Ca3(PO4)20.5 g，葡萄糖 10 g，pH 7.0～7.5 ，固体培养基加2% 的琼脂粉，115℃ 灭菌30 min备用。

1.2 方法

1.2.1 菌株间拮抗反应 将预先培养好的木霉T6和青霉K菌株用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，然后将其接种于PDA固体平板，25℃对峙培养7 d，观察交界处两菌株的生长状况，若交界处两菌株生长弱或不生长，说明两菌株间有拮抗作用，不适合进行混合培养；若交界处两菌株生长良好，则说明两菌株可以共存，两者相互没有抑制作用，不发生拮抗反应，可以进行混合培养[13]。

1.2.2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后解磷能力测定 将活化后的木霉T6菌株和青霉K菌株分别转接到PDA平板培养基上，28℃培养5 d，加入10 mL已灭菌的蒸馏水并滴入0.05 mL 吐温-80，缓慢摇晃，使分生孢子充分脱落，用无菌水将洗脱液稀释成浓度为 108cfu/g分生孢子悬浮液，备用。

混合培养时各取木霉T6菌株和青霉K菌株的菌液0.5 mL接种于盛有100 mL NBRIP液体培养基的三角瓶中，单一培养时每个菌液各取1 mL分别接种于盛有100 mL NBRIP液体培养基的三角瓶中，设不接菌为对照，每个处理重复3 次，置于28℃，150 r/min摇床培养10 d，分别在培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后过滤，滤液8 000 r/min离心10 min，上清液用磷钼蓝分光光度法[14]测定可溶性磷含量，同时用pHS-29A 型酸度计直接测定培养液的pH并记录数据。

1.2.3 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后的促生作用 挑选饱满且大小一致的小麦种子和白菜种子，将其用5%NaClO消毒5 min，并用无菌水冲洗5次。然后将消毒的种子均匀摆放在铺有一层纱布和两层滤纸的培养皿(直径为9 cm)内，每个培养皿100粒，共2皿，待发芽后种入盛有预先灭过菌土壤的花盆中，小麦和白菜各种20盆，每盆10株，各进行4组处理，分别浇木霉菌液5 mL，青霉菌液5 mL，青霉和木霉混合培养液5 mL以及无菌水5 mL，3 d后再补浇1次，第7 d进行幼苗生理生化指标的测定。

幼苗形态指标测定 随机从各处理中抽取25株幼苗，洗净吸干水分后用直尺测定幼苗株高、根系长度和整株鲜重。然后将其置于105℃杀青30 min，70℃烘至恒重，并称其干重。

叶绿素含量测定 选取生长发育正常，无病虫害，无干叶的小麦和白菜的植株叶片，剪碎混匀之后，准确称取0.500 g样品于研钵中充分研磨后，加入95%的无水乙醇过滤到25 mL的容量瓶中，测定其叶绿素a和叶绿素b的D665 nm和D649 nm值，按公式计算叶绿素的含量[15]。

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm，Cb=24.96D649 nm-7.32D665 nm

叶绿素的含量(mg/g)=(C×V) / (1000×W)

2 结果与分析

2.1 拮抗测定

菌株拮抗测试显示，木霉T6菌株和青霉K菌株在同一PDA平板上生长情况与二者单独培养时无明显差异，二者菌丝可以相互融合后正常生长。说明木霉T6菌株和青霉K菌株相互之间无拮抗反应，可以混合培养。

2.2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后解磷能力测定

木霉T6和青霉K混合培养后的溶磷能力强于其单独培养的溶磷能力，且均随着培养时间的延长溶磷能力逐渐增强，到一定时间又趋于稳定。木霉T6于第8 d的溶磷量最大，达90.91 μg/mL；青霉K于第7 d的溶磷量最大，为521.21 μg/mL；木霉T6和青霉K混合培养1～6 d溶磷量随培养时间的延长不断增大，混合培养的溶磷量较木霉T6和青霉K单独培养时的解磷量增加了646.52%和17.82%，且第7 d时达到最大值，为614.06 μg/mL；第7 d后略有下降但相对保持稳定，基本维持在560 μg/mL(图1)。因此，用第7 d的培养液进行盆栽试验。

图1 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后的解磷效果Fig.1 Effect of phosphorus-dissolving after mixed culture ofTrichodermaT6 strain andPenicilliumK

2.3 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后发酵液的pH值变化

木霉T6和青霉K混合培养后发酵液的pH值低于木霉T6和青霉K单独培养的pH值，且随着培养时间的延长pH值均呈逐渐降低趋势并趋于稳定。木霉T6发酵液的pH最初为6.7，第6 d为6.1，之后维持在6.2；青霉K发酵液的pH最初为6.4，第7 d最低，为5.3，之后维持在5.6～5.7；木霉T6和青霉K混合培养后发酵液的pH最初为6.3，第7 d时为3.3，之后维持在3.5(图2)。结合文中2.2可知，在1～10 d的培养时间，各处理溶磷量的变化趋势与其各自发酵液pH的变化趋势相反，其溶磷量最大时，pH值均最低。

图2 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后发酵液的pH值Fig.2 Changes in pH of fermentation broth after mixed culture ofTrichodermaT6 strain andPenicilliumK

2.4 木霉T6菌株和青霉K菌株混合培养后发酵液的促生作用

2.4.1 小麦和白菜幼苗形态指标测定结果 木霉T6和青霉K混合培养能显著促进小麦和白菜幼苗的生长。经木霉T6和青霉K混合培养液处理过的小麦，其株高和根长分别较对照增长54.34%和33.15%，鲜重和干重较对照分别增长43.48%和23.81%。同时，用木霉T6和青霉K混合培养液处理过的小麦较用木霉T6菌液和青霉K菌液单独处理过的小麦株高、根长和干鲜重均有所增加(图3)；白菜的幼苗形态学测定结果表明，经木霉T6和青霉K混合培养液处理后表现出了同小麦相似的促生效果(图4)。用木霉T6和青霉K混合培养液处理后，白菜的株高、根长、鲜重及干重分别较对照增加到306.80%，190.30%，162.5%和133.3%，促生作用极显著。而且混合培养液的效果显著高于单独培养菌液处理的效果。所以木霉T6和青霉K混合培养后的发酵液具有较好的促生作用。

图3 不同处理下小麦幼苗的生长Fig.3 Effect of different treatments on the growth of wheat seedlings 注：A.CK；B.青霉K；C.木霉T6 ；D.木霉T6+青霉K

图4 不同处理下白菜幼苗的生长Fig.4 Effect of different treatments on the growth of cabbage seedlings 注：A.CK；B.青霉K；C.木霉T6 ；D.木霉T6+青霉K

表1 不同处理下小麦和白菜幼苗的生长

注：同列数字后不同小写字母分别表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),下同

2.4.2 小麦和白菜幼苗叶绿素含量测定结果 叶绿素含量测定结果表明，经木霉T6和青霉K混合培养液处理过后，小麦和白菜的叶绿素含量均显著增大。用混合培养液处理后的小麦叶绿素a和叶绿素b的含量较对照分别增加42.70%和981.03%，较单独木霉T6菌液和青霉K菌液处理有一定增加；用木霉T6和青霉K混合培养液处理白菜后，其叶绿素a、叶绿素b含量较对照分别增加355.22%和717.39.78%。叶绿素a和叶绿素b总量较对照、木霉T6菌液和青霉K菌液处理分别增加447.78%，81.92%和61.11%(表2)。

表2 不同处理下小麦和白菜幼苗的叶绿素含量

3 讨论

磷素作为植物生长发育所必需的大量元素，广泛存在于土壤当中，但是却很难被植物所吸收，土壤中的微生物通过协同作用对磷进行转化，进一步被植物利用。目前已发现大量具有解磷作用的微生物，且微生物之间存在着协同作用，这是一个潜能巨大的新的微生物资源。刘青海[16]研究表明，6株溶磷菌和4株固氮菌两两混合培养时，大多数混合体系溶磷能力增强。管国强等[17]研究表明，混合培养菌的溶磷能力比各菌单独培养时要高。苌豹[18]研究发现多种解磷、解钾、固氮菌混合发酵制备的菌糠菌肥比使用单一的解磷、解钾、固氮菌制备的菌糠菌肥的效果更好。试验测定了木霉T6和青霉K混合培养后解磷能力的大小，结果表明，木霉T6和青霉K混合培养的解磷效果好于木霉T6和青霉K单独培养的解磷效果，其中，第7 d时的解磷量最大，达614.06 μg/mL，较木霉T6和青霉K单独培养时的解磷量增加了646.52%和17.82%。解磷菌溶解无机磷的机理主要有产酸作用、胞外多糖协同作用与NH4+的同化作用等[19]，有研究报道[20]，解磷菌融磷量与培养介质pH之间存在显著的相关性，王光华等[20]研究表明，不同溶磷菌株之间溶磷效率与其培养滤液pH之间不存在必然的相关性，但同一菌株的溶磷效率与培养滤液的酸度成正相关。试验发现，木霉T6、青霉K以及二者混合后的融磷量与各自对应菌液的pH变化趋势相反，进一步表明解磷菌株融磷量与培养介质pH值存在一定联系。

张萌[21]研究表明，AiL3和CⅢ-1混合发酵液对辣椒植株种子的生长有一定的作用，但与单菌液相比效果相差不大。相反，赵雅峰等[22]发现产酸克雷伯氏菌Rs-5与枯草芽孢杆菌组合BCL-8按适当比例复配对盐胁迫条件下的棉花具有显著的促生作用。以小麦和白菜为盆栽试材，研究了木霉T6和青霉K混合培养后发酵液的促生作用。结果表明，两株菌混合培养后对小麦和白菜均有显著的促生作用，其效果明显高于二者单独处理和对照，混合培养液可以有效提高小麦和白菜的生长速率，并且叶绿素含量也较对照显著增加。

通过测定木霉T6与青霉K混合培养后的解磷能力及对小麦和白菜幼苗的促生作用发现，二者混合培养后的解磷能力及促生效果均较单一培养时有显著提高。为后期混合制剂的研制奠定了基础，也为生防菌株的复合利用提供了重要的理论依据，但本研究仅对禾本科和十字花科中的典型代表小麦与白菜作了盆栽试验，供试材料较少，而未对其他的植物做研究，其促生作用是否依然显著有待于进一步研究。

4 结论

试验研究了木霉T6与青霉K混合培养后的解磷能力及促生作用，发现混合培养后溶磷能力及促生功能有了明显的提高。解磷试验结果表明：木霉T6与青霉K混合培养的解磷量较各自单独培养分别增加了646.52%和17.82%。盆栽试验结果表明，二者混合培养发酵液对小麦和白菜具有明显的促生作用，小麦和白菜的叶绿素、鲜重等生理指标的较CK显著增加。因此，木霉T6与青霉K菌株混合培养具有很好的溶磷促生作用，对后期二者混合生防制剂的研制及其他方面的应用具有重要的理论意义。