芒果苷改善肝损伤模型小鼠肝功能实验研究

陈 星 ，夏晓冬 ，童德银 ，车道标 ，2

（1.江苏省宿迁市第一人民医院，江苏 宿迁 223800； 2.江苏省人民医院，江苏 南京 210029）

肝纤维化发病机制复杂，与活化的肝星状细胞沉积细胞外基质有密切关系[1-2]。肝星状细胞活化过程中产生大量的促炎因子、趋化因子和分子，许多炎性因子在肝星状细胞的活化中起着关键作用，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素 1β（IL-1β）和白细胞介素 6（IL-6）[3]。此外，核因子κB（NF-κB）、活性氧、脂质过氧化产物和多种生长因子也促进肝星状细胞的增殖，与增加的肌成纤维细胞共同作用，最终导致肝纤维化的多种信号通路的病理生理改变。转化生长因子β（TGF-β）等分子靶标在肝脏纤维化中具有重要意义。TGF-β是生长因子基因超家族中特征性细胞因子[4-5]，分布广泛，被认为是强有力的促纤维化介质，可促进肝星状细胞的活化和细胞外基质蛋白的沉积，从而导致肝纤维化[6]。同时，TGF-β与肝硬化的发展密切相关，可刺激细胞外基质蛋白的产生并消除基质蛋白的去除现象[7-9]。芒果苷是芒果叶的主要成分，是一种四羟基吡酮的碳糖苷，属双苯吡酮类化合物，具有抗炎和神经保护等多种药理特性[10]。本研究中探讨了芒果苷对四氯化碳肝损伤模型小鼠的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

动物：无菌级ICR小鼠50只，雄性，8～12周，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号 SCXK（沪）2008-0016。所有动物于室温（22 ± 1）℃，空气相对湿度40% ～50%，昼夜交替12 h，普通饲料喂养，自由进食、饮水。

仪器：UV-3200S型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；BH-2型光学显微镜（日本 Olympus公司）；DYCZ-24KS型电泳仪（北京六一仪器厂）。

试药：芒果苷（美国Sigma公司，批号为111607-200301）；所有抗体均购自 Cell Signaling Technology；TNF-α，IL-6，IL-1β 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号分别为 20060922，20060925，20060926），均购自南京凯基生物技术公司；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号分别为20160514，20161157）均购自南京建成生物工程研究所；苏木素-伊红染液（HE，北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 方法

分组、给药与建模：将50只ICR小鼠随机分为5组，即空白对照组（A组，等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（B组，等体积0.9%氯化钠溶液）、水飞蓟素组（C组，0.1 g／kg）和芒果苷低、高剂量组（D1组、D2组，20，40 mg／kg），各10只。上述后4组小鼠皮下注射四氯化碳 -橄榄油（1 ∶1，V／V)，3 mL／kg，每周 2 次，连续6周，以建立小鼠肝纤维化模型。空白对照组小鼠皮下注射等量橄榄油。建模成功后，各组小鼠灌胃相应药物，每天1次，连续6周。

肝脏组织病理学检查：小鼠眼眶取血后处死，将肝脏组织固定于4%中性福尔马林溶液中过夜。将组织固定包埋于石蜡中，切成4 mm厚的切片。然后去石蜡，HE染色，采用光学显微镜观察肝脏病理改变情况。

AST和ALT活性检测：采用干化学法和全自动生化分析仪检测小鼠血清AST和ALT活性，严格按试剂盒说明书步骤操作。

TNF-α，IL-1β，IL-6含量检测：采用 ELISA 法检测小鼠血清 TNF-α，IL-1β，IL-6含量。严格按试剂盒说明书步骤操作。

炎性相关因子蛋白表达水平检测：采用Western blot法检测。将小鼠肝组织剪碎，取50 mg，加1 mL RIPA裂解液提取总蛋白，12 000 r／min离心15 min，收集上清液，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。各组取20 μg上样，转膜至PVDF膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST清洗3次，加入一抗，4℃ 孵育过夜，回收一抗，TBST清洗4次，加入二抗，室温振摇2 h，回收二抗，TBST清洗4次，加入ECL化学发光试剂，将PVDF膜放入暗盒中，压上X胶片，取出胶片后显影、定影、清洗。然后，通过Image J软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件分析。计量资料以 X±s表示，行 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对肝组织病理形态学的影响

A组小鼠肝脏中央静脉和周围肝细胞结构正常。B组小鼠肝组织细胞存在气球样变性和脂肪变化，上述气球样变性和脂肪变化与纤维结缔组织链和严重炎性细胞浸润相关。C组和D1组、D2组上述肝组织病理形态学均有不同程度改善。详见图1。

2.2 其他观察指标

结果见表1和图2。与A组比较，B组小鼠肝组织匀浆中正Nod样受体蛋白3（NLRP3），凋亡相关斑点样蛋白（ASC），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 1（Caspase-1），IL-1β，p-P65，P65，核因子 κB 抑制因子 α（IκBα），TGF- β，p-Samd-3，Smad-3 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与 B组比较，C组和D1组、D2组小鼠肝组织匀浆中蛋白表达水平均显著降低（P ＜0.01）。

3 讨论

图1 肝组织病理形态学（×200）

表1 各组小鼠血清转氨酶活性和炎性因子水平比较（X ±s，n＝10）

图2 肝组织匀浆中相关炎性因子蛋白表达

抑制炎症相关途径是治疗肝纤维化的有效靶点。本研究结果显示，芒果苷可通过抑制 NLRP3，ASC，Caspase-1的表达，降低 p-P65和p-IκBα的生成，抑制TGF-β和p-Samd-3在肝组织中的表达，从而抑制NLRP3炎症小体反应。四氯化碳已被广泛用于实验性诱导肝纤维化[11-12]，其产生过量自由基，导致肝细胞膜脂质过氧化，随后释放炎性细胞因子和损伤肝细胞。本研究结果显示，20 mg／kg和40 mg／kg芒果苷能显著改善模型小鼠ALT、AST、炎性细胞因子水平和肝组织病理形态等。

炎性过程为涉及成纤维过程的主要事件[13]。肝脏损伤时，肝巨噬细胞可激活NF-κB及其下游信号传导。NF-κB作为转录因子，上调多种炎性细胞因子的释放，包括 TNF-α，IL-6，IL-1β。TNF-α，IL-6，IL-1β，进一步维持炎性级联反应。本研究结果显示，四氯化碳可增加小鼠血清 TNF-α，IL-6，IL-1β含量，升高p-IκBα表达水平，从而加重肝脏炎症和纤维化[14]。20 mg／kg和 40 mg／kg芒果苷能显著降低模型小鼠TNF-α，IL-6，IL-1β 的水平，对 NF-κB 信号转导也有明显的抑制作用。

TGF-β可促进肝星状细胞的活化和细胞外基质蛋白的积累，导致肝纤维化，其过量产生会刺激细胞外基质蛋白的各种成分的合成和释放。一旦激活，TGF-β结合到Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸／苏氨酸激酶受体，将激活受体调节的SMAS，包括Smad-3。活化Smads的核易位是操纵TGF-β依赖基因的基本过程。TGF-β／Smad信号通路失活可能是抗肝纤维化的一个有前途的治疗靶点。本研究结果显示，在四氯化碳处理的小鼠中，TGF-β和Smad-3磷酸的表达水平升高，20mg／kg和 40 mg／kg芒果苷可显著抑制Smad-3和TGF-β的磷酸化。

综上所述，芒果苷对肝损伤模型小鼠具有一定改善作用，其机制与降低炎性反应有关。参考文献：

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