兔磨牙压低过程中牙根吸收与DPP表达相关性的研究

李海清 ，徐 芳 ，吴丽春 ，李明博 ，戴 艳

（ 1.黑龙江省医院，黑龙江 哈尔滨，150000；2.佳木斯大学医学院，黑龙江 佳木斯，154007）

牙根吸收是牙齿压低过程中最常见的并发症之一[1]。临床上，早期很难检测到牙根吸收并且牙根吸收没有有效的治疗措施[2]，因此寻找一种早期检测牙根吸收并且可以监测牙根吸收的发生、发展及修复的指标对于正畸临床具有重要意义。牙本质磷蛋白（dentin phosphoproteins ,DPP）属于牙本质的特异性蛋白[3]，参与牙本质的生物矿化与再矿化[4]，在牙根吸收过程中，这些蛋白质会释放到龈沟液中[5]，因此在牙根吸收过程中龈沟液中的DPP发生变化。本研究检测了一个加力周期龈沟液中DPP含量的变化及组织学上牙根吸收的情况，探讨DPP与牙根吸收发生、发展及修复的关系。

1 材料和方法

1.1 建立新西兰大白兔正畸压低牙齿致根吸收的模型

随机取66只月龄相同（4个月大），体重4±0.3Kg，雄性新西兰大白兔（黑龙江省哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物有限公司），0.1%的戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，用手术刀沿口角至左侧下颌第一磨牙根尖部将组织切开，暴露根尖部骨组织，在下颌骨下缘上2mm，植入支抗钉，支抗钉直径4mm,长度16mm，植入支抗钉时避免破坏牙根根尖部。再用高速涡轮手机在新西兰大白兔左侧下颌第一磨距牙颌面1/3处磨深约 0．5 mm的固位沟，用 1 根直径 0.2 mm 的结扎丝，结扎丝套上橡皮链，环绕固位沟与左侧下颌第一磨牙拧紧，将橡皮链拉伸，用SP strain gauge进行测力（可重复性达95%以上），测力计测释放 50 g 力值的橡皮链套入支抗钉（图 1）。

图 1 大鼠正畸牙移动致牙根吸收模型Figure 1 Root-absorption model of orthodontic tooth movement in rats

1.2 龈沟液的采集与 DPP 浓度检测

上述新西兰大白兔随机分为不加力组33只和加力50g组33只，分别于第 0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d、24d、27d、30d 提取左侧下颌第一磨牙龈沟液，并进行样本处理，将预先准备好的20号吸潮指尖装于一个 EP 管内，称重，高温高压消毒后烘干备用。将兔麻醉并固定，然后清洁吹干实验牙，将吸潮指尖分别放入实验牙近、远中的颊、舌侧龈沟内，轻轻放入不加压，放置 30 s 后取出，按此方法间隔 2 min ，重复 3次取平均值。将取液后的吸潮指尖放入于 EP 管称重，储存在－70 ℃冰箱备用。两次称重值之差为龈沟液的重量 G。根据浓度C为1 mg/μL 换算体积 V＝G/C。取出冷冻待检样本平衡至室温，每个 EP 管加入 0.01 mol/L，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液120μL，浸泡并震荡lh，1500r/min×15 min离心。使用大白兔牙本质磷蛋白定量 ELASA试剂盒，双抗体夹心 ABC－ELASA 法测出450nm 处OD值，绘制标准曲线，求出标本中 DPP 浓度。

1.3 组织标本制备，染色与图像分析

取龈沟液后，将4%多聚甲醛经新西兰大白兔的心脏灌注，处死。切取下颌骨组织（左侧下颌磨牙区及其周围牙槽骨组织），经4%多聚甲醛液固定48 h后，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）常温脱钙6周，然后经过一系列梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，最终将标本沿磨牙长轴进行近远中向连续切片，每张厚约6μm。选取可见到左侧下颌第一磨牙根尖部的组织切片，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色以观察牙根吸收陷窝面积和破牙骨质细胞数量。HE 染色测量牙根表面吸收陷窝面积，Motic3000显微摄影系统于100倍下摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对牙本质面积进行分析，此分析是通过计算牙根吸收相对面积来表达，公式如下：根吸收相对面积＝一个视野内根吸收面积／该视野内根面总长度。抗酒石酸酸性磷酸酶主要来源于破骨细胞，因而测量牙体中TRAP 可以了解破骨细胞的功能状态及数量。Motic3000显微摄影系统于400倍下摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对左侧下颌第一磨牙根尖区TRAP阳性表达进行定量分析，以积分光密度(IOD) 代表抗酒石酸酸性磷酸酶蛋白相对表达量，进而表达破骨细胞的数量，积分光密度（IOD）=阳性面积×平均光密度，每例随机分析3个高倍镜视野，每个视野选取3个不同区域相同面积，取其均值代表该视野蛋白的相对表达量。用 Motic Images Advanced 3.2图像分析软件分析，TRAP 染色计算破牙骨质细胞的含量，重复3次后取平均值。

1.4 统计分析

本实验数据用 SPSS 18．0分析软件对龈沟液中 DPP 浓度进行单因素方差分析（one－way ANOVA），将龈沟液中 DPP 浓度分别与牙根吸收相对面积、TRAP 染色阳性细胞含量进行双变量相关分析（Bivariate Correlations）和线性回归分析（Linear Regression）。

2 结 果

2.1 大体标本观察

不加力组：牙齿临床冠高度不变；加力50g组：实验牙被平均压低约1±0.11mm。

2.2 ELASA 检测加力50g组左侧下颌第一磨牙龈沟液中 DPP 浓度变化

加力30d，第0d到6d,DPP浓度逐渐升高，从（23.65±0.75）μg/mg 升高至 （30.93±2.01）μg/mg； 第6d到15d浓 度 相 对 稳 定， 从（30.93±2.01）μg/mg 至 （31.07±1.16）μg/mg之间波动，第15d到第21d浓度又再度 升 高， 从（31.07±1.16）μg/mg 升 高 至（36.17±1.03）μg/mg；第21d到第30d浓度降低,从（36.17±1.03）μg/mg 降低至 （24.05±1.04）μg/mg；而不加力组，DPP浓度一直处于稳定水平（24．41±2.79）μg/mg，不同组间显示有明显的统计学差异（P＜0.01）。（表1）

绘制不加力组与加力组DPP浓度变化曲线图（图 2）。

图 2 兔下颌第一磨牙龈沟液 DPP 浓度变化曲线图Figure 2 Curve of DPP concentration in gingival crevicular fluid of rabbit mandibular first molar

兔下颌左侧第一磨牙根尖区表面持续加力第0d～6d，HE染色吸收陷窝的相对面积逐渐从 430.71±6.88增 加 到 623.37±9.74； 第 6d～ 15d从 623.37±9.74到 621.41±6.70面 积 相对稳定，第15d～21d从621.41±6.70减少到432.97±9.94，第 21d～ 30d从 432.97±9.94减少到428.93±7.20面积相对稳定。牙根吸收陷窝的相对面积在两组之间存在变化，并且明显（P＜0.01）。修复性牙本质在图3中可观察到。

持续加力第 0d ～15d，第一磨牙根尖区表面TRAP染色阳性IOD值检测破骨细胞数688.69±10.28逐渐增多至 1418.06±7.53，第15d～30d减少至697.71±7.04（表 2）。不加力组和加力50g组切片相比，TRAP 染色阳性破牙骨质细胞数量明显变化，图4可见TRAP染色阳性细胞。

图 3修复性牙本质（HE 染色×100）Figure 3 also shows repairing dentin

图4 见 TRAP 染色阳性细胞（TRAP 染色×400）Figure 4 No TRAP staining positive cells

表1 大白兔下颌第一磨牙龈沟液 DPP 浓度 （μg／mg，x±s）Figure 1 The concentration of DPP in gingival crevicular fluid of the first mandibular molar of rabbits (ug/mg, x+s).

表 2 兔下颌第一磨牙根尖区表面 HE 和 TRAP 染色结果 （x±s）Table 2 The results of TRAP and HE staining on the apical surface of the first mandibular molar in rabbits (x±s).

表3 龈沟液中 DPP 浓度与牙根吸收相对面积双变量相关分析Table 3 Bivariate correlation analysis between DPP concentration in gingival crevicular fluid and relative root resorption area

2.4 双变量相关分析和线性回归分析

我们把两个变量牙本质磷蛋白DPP和牙根的吸收陷窝相对面积，做散点图，发现两者之间存在相关性，呈直线趋势，经过双变量分析,得出了相关系数Pearson为0.533，P＜0．05，可以认为这两个变量之间是有关联的（表3）。我们进一步将两者进行线性回归得出回归方程，方程式如下：DPP浓度(y)=16.9400.026×相对面积(x)（表4），在此过程中我们并未发现TRAP染色阳性破牙骨质细胞表达量与DPP浓度之间存在特别明显的相关趋势。

3 讨 论

牙齿压低是正畸治疗中一种常见的牙齿移动方式[6]，但牙齿压低过程很容易出现牙根吸收，牙根吸收具有不可逆性，同时临床没有有效的治疗方法，因此寻找一种简单、无破坏性的指标来检测牙根吸收及修复的过程，对临床上牙齿的矫正具有重要的意义。免疫定位研究显示 DPP 局限于矿化牙本质层，通过矿化前沿的成牙本质细胞分泌[7]，具有特异性，它是牙本质中含量最丰富的非胶原蛋白，占50%[9]，DPP 调控着羟基磷灰石晶体生成[10]，并直接参与控制牙本质矿化。在牙根吸收过程中牙本质细胞分泌DPP，并通过龈沟液渗透出来。

本研究通过 ELASA 定量分析一个加力周期龈沟液中DPP含量变化的规律，在相同的时间点通过HE染色检测了牙根吸收的相对面积，通过相关与回归分析根吸收相对面积和龈沟液中的DPP浓度，发现这两变量之间是有联系的。在根吸收发展早期，DPP浓度随着根吸收面积的增加而呈现增多趋势，DPP浓度在牙根继续吸收但根吸收横截面积不变时呈现出稳定的状态；DPP浓度在根吸收修复时又会增多；DPP浓度在根修复逐渐完成时降低至原有水平。这一结论与李文星等研究一致[11]。

而通过 TRAP 染色阳性检测的破牙骨质细胞数量机械力作用下，第 15d达到峰值之后便逐渐减少；加力 21d 后几乎未见 TRAP 染色阳性细胞，此时根吸收面积明显减少，牙根可能有修复现象。从这一现象中我们可以得出在机械力作用下，根吸收不会一直持续下去，而是逐渐达到一个稳定状态后会出现修复的情况，骨吸收陷窝中会出现新生骨，有时牙本质深处的吸收陷窝也会被新生骨修复，其他学者研究结论中也有相似报道[12]。本研究也在15d后观察到出现了修复性的牙本质。

牙根吸收及修复是一个间断的过程，我们以DPP作为根吸收的指标，在时间的纵轴上寻找这种蛋白在龈沟液中含量的变化，并与组织学上牙根吸收的相对面积、牙根吸收的破骨细胞数相关联。龈沟液中的DPP浓度与正畸根吸收的发生、发展、修复密切相关，DPP可以作为一种安全的生物分子，来动态的反应正畸根吸收及修复。

表 4龈沟液中 DPP 浓度与牙根吸收相对面积线性回归分析结果Table 4 Linear regression analysis of DPP concentration in gingival crevicular fluid and relative area of root resorption