禽类就巢性状的遗传调控

尹玲倩，冉金山，李菁菁，任鹏，张贤娴，刘益平



禽类就巢性状的遗传调控

尹玲倩，冉金山，李菁菁，任鹏，张贤娴，刘益平

四川农业大学，畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130

就巢在家养禽类中普遍存在，主要表现为食欲减退、停止产蛋并开始孵化等行为变化。此外，就巢期禽类的卵巢及输卵管的生理形态也会发生显著的变化。禽类就巢性是一种由常染色体上的多基因控制的低遗传力性状，主要受环境因素、内分泌因素和遗传因素的影响。就巢性的研究最初开始于对禽类就巢行为特征的观测，随着技术的发展，逐渐深入到禽类就巢性的遗传方式、内分泌因素、就巢性候选基因及其多态性的研究。近几年随着高通量测序技术的发展，利用基因组学、转录组学和多组学联合分析来筛选与禽类就巢性相关的候选基因和信号通路，同时调控禽类就巢性的分子机制也逐渐被揭示。本文从不同层面对调控禽类就巢性的基因、microRNAs和信号通路进行了综述，以期为后续探究禽类就巢性的具体分子机制提供参考。

家禽；就巢性；繁殖激素；候选基因；microRNA；信号通路

同大多数脊椎动物相比，禽类具有一种典型的繁殖特征，即就巢性。就巢行为是禽类为适应多变的环境，在漫长的自然选择中形成的一种利于繁衍后代和扩大群体规模的本能行为。这种行为主要表现在母禽进入产蛋窝巢的次数增加，同时伴随着停留时间延长，最终停止产卵而进行孵化。如果禽类长期处于典型就巢状态，会引起输卵管和卵巢发生萎缩，严重降低产蛋量甚至休产。姜润深等[1]根据鸡就巢时间和卧息时间长短，将鸡的就巢行为分为3种类型，即非就巢型、非典型就巢型和典型就巢型。影响禽类就巢的因素主要分为环境因素、内分泌因素和遗传因素。环境因素中光照和温度对就巢行为的影响较大，阴暗和高温环境会诱导禽类产生就巢行为。繁殖激素等内分泌因子直接参与禽类就巢性的调控，其中催乳素(prolactin, PRL)是引起和维持家禽就巢行为的主要激素。遗传因素是导致禽类产生就巢性的根本原因，对于就巢性的遗传规律有多种解释，但最终证实控制就巢性的基因位于常染色体上，其中有研究推测白来航鸡基因启动 子中的一段24 bp的纯合插入序列可能会影响白来航鸡体内的表达，进而影响白来航母鸡的就 巢性[2,3]。

与产蛋期母禽相比，就巢期母禽的繁殖行为和生殖系统的形态都发生了显著变化。就巢期间禽类的卵巢出现了严重的萎缩与退化，无等级卵泡发育或极少数发育的等级卵泡停止发育并出现闭锁，卵泡中颗粒细胞层和膜细胞显著减少[4~7]。深入研究发现，造成就巢期禽类卵巢形态发生改变的直接原因是由于禽类体内的内分泌激素的含量发生改变，其中主要是繁殖激素含量的改变。通过对就巢期禽类血清中的繁殖激素进行测定，发现处于就巢期的鸡、鸭、鹅和火鸡()的血清中PRL含量显著高于产蛋期[5,8,9]。此外，雌二醇(estradiol, E2)、孕激素(progesterone, P4)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)等繁殖激素同样也被证实参与禽类就巢性的调控[10,11]。除繁殖激素外，许多神经内分泌因子，如催乳素释放因子血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)[12]、多巴胺(dopamine, DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HA)[13,14]等，也能够通过影响PRL的合成与释放间接调控禽类的就巢行为。

尽管通过主动、被动免疫和环境调控可以在一定程度上降低就巢行为的发生率，但这种方法并不适用于现代化大规模的禽业生产。因此，从根本上消除禽类的就巢性是目前亟待解决的问题。开展就巢性相关候选基因的研究有助于确定控制就巢性状的主效基因，深入了解就巢性的遗传基础和具体的分子机制，最终通过遗传育种的方法培育无就巢性的禽类品种，以此来提高家禽的繁殖性能。近几年在环境和内分泌研究的基础上，研究人员从分子层面进一步揭示了调控禽类就巢性的因素，并对抑制或消除就巢性的方法进行探索。本文根据前人对禽类就巢性的研究，对参与调控禽类就巢性的基因、miRNA和信号通路进行了综述。

1 参与就巢性调控的基因

1.1 繁殖激素相关基因

生殖激素含量的变化是诱导禽类产生就巢性的直接原因。最初，研究主要集中于、和等繁殖激素相关基因的表达和多态性的分析。Jiang等[2]在探究绿壳蛋鸡中和基因的变异对繁殖性状的影响时发现，基因启动子区域的PRLpro2位点的插入/缺失突变对平养绿壳蛋鸡的就巢性有显著的影响。朱盼[15]利用荧光定量PCR技术检测了在4个时期中皖西白鹅垂体、下丘脑、卵巢3个组织中基因的表达水平，发现基因在就巢期的表达量最高，且在就巢前期的表达量达到最大，卵巢中基因的表达水平显著高于下丘脑和垂体。但是，段修军等[16]研究发现在就巢期的垂体中表达量高于卵巢和下丘脑。这可能是由于禽类所处的就巢期阶段不同和物种差异所导致。此外，基因的不同单倍型所表现出来的就巢行为也存在差异。梁勇等[17]发现催乳素基因内含子2的第35碱基(T/C)位点、内含子4的第1824碱基(A/G)位点的突变会导致家鸡群体表现出不同的就巢率。

除和外，其他繁殖激素基因也被证实参与禽类就巢性的调控。吴国平[18]对浙东白鹅繁殖周期中、和基因的表达进行了分析，发现和的表达量在就巢期的浙东白鹅垂体中显著下调表达。张响英等[19]检测了处于不同繁殖周期的狮头鹅3种组织中促卵泡素β亚基(follicle- stimulating hormone β,)和促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,)基因的表达水平，结果表明和在产蛋期的相对表达量极显著高于就巢期和休产期，由此推测及表达水平的变化与鹅的繁殖周期密切相关。Wu等[20]对的研究也得到了相似的结果，就巢期番鸭下丘脑、垂体和卵巢等组织中的表达量显著低于产蛋期。在禽类不同的繁殖周期中，、、和基因具有相似的表达模式，而和具有相反的表达模式。因此推测就巢禽类的部分组织中、、和的表达会受到和基因的抑制性调控，从而诱导就巢行为的发生；反之，在非就巢期禽类的体内、、和的表达量上调则会抑制和基因的表达，从而抑制禽类的就巢行为的发生。综上所述，可以发现调控禽类繁殖行为的、、、、和基因都是参与就巢性调控的候选基因。

1.2 其他相关基因

就巢性是一种受多基因控制的复杂性状，除了繁殖激素相关基因外，研究者还发现了其他参与就巢性调控的基因，如多巴胺D1/D2受体基因(dopamine D1/2 receptor,)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,)及其受体(vasoactive inte­stinal polypeptide receptor,)基因等。和被证实参与了禽类繁殖行为的调控。Xu等[21]在探究基因及其单倍型对鸡蛋产量和就巢性状的影响时，发现基因4个SNP位点变异与就巢频率显著相关，且基因在非就巢鸡的皮下和腹部脂肪中的表达显著高于处于就巢期的鸡。基因中的两个位点A-16105G和T+619C也被认为与鹅的就巢行为显著相关，A-16105G主要与就巢频率相关，而T+619C则参与调控就巢行为持续时间的长短[22]。此外，有研究表明及可能也是调控鸡就巢性的候选基因。对斑胸草雀()就巢性的研究中发现，当雌性和雄性斑胸草雀处于就巢的情况下，其大脑中的转录活性增强[23]。Zhou等[24]发现基因序列中的C+598T和C+53327T的变异与禽类的就巢性显著相关，前者主要与就巢频率有关，而后者主要控制就巢持续时间的长短。相关的研究也表明基因的表达与多巴胺受体基因之间存在相互作用关系，VIP和PRL的分泌受下丘脑刺激性和抑制性的双重作用[25,26]。

除上述4种基因外，Shen等[27]通过抑制性消减杂交技术(suppressive subtractive hybridization, SSH)分析证实GTP酶激活Rap/RanGAP域样-1(GTPase activating Rap/RanGAP domain-like 1,)也是参与鸡就巢性调控的候选基因，在就巢期的鸡下丘脑和垂体中的表达水平显着高于非就巢的鸡。Xu等[28]通过转录组测序发现胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme,)和多巴胺β-羟基酶(dopamine beta-hydroxylas,) 基因在就巢期的禽类卵泡中高度表达，这两个基因可作为参与就巢性调控的候选基因。Liu等[29]通过比较就巢初期和产蛋期的鹅的下丘脑、垂体、卵巢基质和非等级卵泡壁的转录组，发现催产素-神经生长素(oxytocin-neurophysin,)、脊索生成素样蛋白1 (chordin-like protein 1,)和生长激素(growth hormone,)可能是参与就巢性调控的新候选基因；此外，还发现下丘脑分泌素(hypocretin,)和阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,)这两个与食欲调控相关的基因在就巢初期鹅的下丘脑组织中显著差异表达，因此推测就巢初期食欲减退可能是禽类就巢行为的第一步表现，同时也是引发鹅产生就巢行为的决定性因素。Liu等[7]利用全转录组技术比较分析就巢期和产蛋期鸡的卵巢组织，筛选出大量与就巢性相关的基因：如与繁殖过程相关的基质金属肽酶2 (matrix metallopeptidase 2,)、细胞色素P450家族1亚家族B成员1 (cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1,)、多巴胺β-羟化酶(dopamine beta-hydroxylase,)、抑制素β A/B(inhibin beta A/B,)和催产素受体 (oxytocin receptor,)基因等；与细胞增殖凋亡相关的Smad家族成员2 (Smad family member 2,)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen- activated protein kinases 11,)、S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,)、受体相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase-1,)、生长停滞和DNA损伤诱导45 (growth arrest and DNA damage-inducible 45,)基因和基因家族。

此外，褪黑素受体(melatonin receptor 1C,)[30]、抗缪勒氏管激素受体Ⅱ (Anti-Müllerian hormone receptor Ⅱ,)[31]、雷帕霉素靶蛋白基因(mec­hanistic target of rapamycin,)[32]、核受体辅激活蛋白1 (nuclear receptor co-activator 1,)、胆固醇调节元件结合蛋白2 (sterol regulatory element binding transcription factor 2,)、Ral GTP酶活化蛋白亚基α-1 (Ral-GTPase activating protein α-1,)[33]和垂体特异转录因子(POU- domain family of transcriptional activators,)[34]等基因也被证实参与禽类就巢性的调控(表1)。

2 参与就巢性调控的microRNAs

近期研究表明，microRNAs(miRNAs)参与哺乳动物的卵巢性腺发育、类固醇生成、细胞凋亡、排卵和禽类就巢性等过程的调控(表1)。Xu等[35]通过Solexa测序技术筛选出大量与禽类繁殖相关的miRNAs，其中G-miR-320、G-miR-202、G-miR-146和G-miR-143*被证实参与禽类就巢行为的调控。Chen等[36]利用高通量测序技术比较不同繁殖时期鹅的卵巢组织，也证实G-miR-146和G-miR-143*参与禽类就巢性的调控；此外，还发现let-7家族在两个测试组中表达量最丰富，其次是miR-146家族和miR-143家族；在两组卵巢组织中还筛选出4个新的差异表达的miRNAs，分别是miRn1、miRn10、miRn11和miRn12，且miRn1仅在就巢组中表达；对新的miRNAs进行功能预测分析，发现miRn10和miRn11参与卵巢中的转录调控。Yu等[37]也发现let-7、miR-10、miR-30和miR-199家族参与不同时期鹅卵泡的发育，并推测这4个miRNA家族是调控卵泡发育过程中的核心因素。Liu等[7]利用全转录组测序筛选出大量与就巢性相关的非编码RNA，如p53信号通路中的重要调控因子miR-34b 和 miR-34c，参与卵巢类固醇合成调控的miR-18、miR-98、miR-128、miR-135和miR-148等。综上所述，参与繁殖活动调控的miRNAs主要分为两类：一类参与就巢期卵巢内繁殖激素调节途径；另一类调控卵巢内体细胞和生殖细胞的增殖与凋亡。

2.1 参与卵巢类固醇激素合成的microRNAs

卵巢中类固醇激素的水平与卵巢上卵泡的发育状态和排卵有着直接的联系，类固醇激素的合成受到许多酶和转录因子的调控。近年来的研究也证实miRNAs在调控卵巢类固醇合成中扮演着重要的角色。作为一个多功能的miRNA，miR-132被证实参与调控禽类卵巢中类固醇激素的合成。Sang等[38]发现miR-132在多囊卵泡综合征患者的卵泡液中下调表达，并且参与卵泡中雌二醇的合成。Wu等[39]通过向体外培养小鼠的原代颗粒细胞转入miR-132模拟物，发现其能够显著上调颗粒细胞中雌激素的浓度，进一步研究表明，miR-132主要是通过结合其靶基因孤儿核受体1 (neural orphan nuclear receptor 1,)基因，抑制的表达，进而减少对细胞色素P450 19A1 (cytochrome P450 19A1,)基因的抑制作用，促进雌二醇的生物合成。

表1 家禽就巢性相关基因及其信号通路

miR-320也被证实参与调控卵巢类固醇激素的合成。Zhang等[40]研究miR-320的表达对多囊卵巢综合征患者卵丘细胞中雌二醇含量的影响，发现miR- 320主要是通过miR-320a//()级联系统来调控卵丘细胞中胰岛素样生长因子1 (insulin-like growth factor 1,)基因诱导的孕酮和雌二醇产生，抑制miR-320a表达会显著降低正常卵丘细胞中孕酮和雌二醇产生。Sang等[38]为了探究人卵泡液中与类固醇合成有关的miRNAs，将选择的12个miRNAs类似物和抑制剂转染到体外培养的人卵巢颗粒样肿瘤细胞(steroidogenic human granulosa- like tumor cell line, KGN)中，发现miR-320类似物能够促进雌二醇的分泌，添加其抑制剂会导致雌二醇分泌降低。

此外，也有研究表明miRNAs可以通过调控颗粒细胞中芳香化酶基因的表达来影响雌二醇的合成。Xu等[41]发现miR-378通过与芳香化酶基因的3¢-UTR中的两个结合位点结合，干扰芳香化酶的正常功能，以此来减少猪卵泡颗粒细胞中雌二醇的产生。Yao等[42]的研究则发现miR-224在转化生长因子β 1 (transforming growth factor beta, TGF-β1)处理的小鼠腔前颗粒细胞(granulosa cell, GC)中显著上调表达，miR-224可以靶向结合来增强TGF-β1诱导的GC细胞增殖，并且miR-224和TGF-β1均可通过增加的转录水平促进GC细胞释放雌二醇。

2.2 参与卵巢细胞增殖和凋亡的microRNAs

处于就巢期的禽类，其生殖器官在功能上显著退化。先前的研究不仅证实了就巢期禽类的卵巢中类固醇生成减少，也发现在就巢期禽类的卵巢中细胞增殖和凋亡过程显著减缓[7]。大量研究表明，miRNAs参与许多通路中细胞增殖和凋亡基因的表达调控。miR-202主要在脊椎动物的性腺中表达，近期关于miR-202的研究主要集中在其对肿瘤细胞增殖的调控方面，证实miR-202是多种疾病早期诊断的标志物。此外，也有研究表明miR-202参与繁殖相关活动的调控。Xu等[35]的研究发现，miR-202在就巢期鹅的卵泡中显著上调表达。Zhang等[43]发现miR-202-5p主要在斑马鱼()的卵母细胞中表达和积累。Gay等[44]利用CRISPR/ Cas9技术对青鳉()体内的miR-202进行敲除，发现miR-202缺失会损害早期卵泡的发育，降低卵巢中成熟卵泡的数量和质量，证实miR-202是参与调节雌性卵泡募集和生长的关键miRNA。除了参与卵泡的生长发育调控，miR-202还能协同雌激素调控鸡胚胎的性别分化，miR-202的上调与鸡胚性腺中的雄性睾丸的分化一致[45]。

miR-320在调控就巢期禽类卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡中也发挥了重要的作用。有研究发现miR-320在就巢期的鹅卵巢中的表达量显著低于产蛋期[35]。Feng等[46]研究发现，在分裂细胞数量较多的早期胚胎中，miR-320的表达量显著高于分裂细胞数量较少的早期胚胎，敲除小鼠卵母细胞中mmu-miR-320会显著抑制卵母细胞的进一步分裂。也有研究发现miR-320在调控颗粒细胞的功能中发挥着重要的作用。如Yin等[47]发现miR-320主要在发育阶段的小鼠卵泡颗粒细胞和卵母细胞中表达；此外，miR-320可以通过靶向结合转录因子E2F1和SF-1蛋白调节卵泡发育中颗粒细胞的增殖。

除了上述两种miRNAs，有研究证实miR-224[48]、miR-26a-5p[49]、miR-148b[50]和miR-214[51]等也参与卵巢中卵泡的发育和颗粒细胞、膜细胞的增殖调控。近期的研究发现，大量与细胞凋亡和自噬相关的miRNAs在就巢期和产蛋期的禽类下丘脑、卵巢和卵泡中差异表达，如miR-21[52]、miR-204[53]、miR-205[54]、G-miR-34b-5p、miR-6006和G-miR-1620[7]等。

miR-205是一种高度保守的miRNA，能够通过多条途径调控细胞的凋亡。Tian等[55]发现miR-205可以直接靶向结合抗凋亡基因，通过调控的表达来抑制细胞的增殖，诱导细胞凋亡。Zhang等[56]证实miR-205在患慢性肾病小鼠的肾细胞中显著下调表达，通过体内、体外实验证实miR-205通过与趋化因子样因子(CKLF)样MARVEL跨膜结构域家族成员4 (Chemokine-like factor (CKLF)-like MARVEL transmembrane domain-containing family,) mRNA的3'UTR结合，调控基因的表达，进而抑制细胞的凋亡。此外，也有研究证实miR-205参与繁殖活动的调控。如Zhang等[54]研究miR-205在小鼠颗粒细胞(mGCs)中的表达，发现在闭锁的卵泡中miR-205的表达量显著增加，环腺苷一磷酸反应元件结合蛋白1 (cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1,)是其直接的靶向基因；同时发现过表达miR- 205可以通过改变小鼠卵泡中促凋亡因子的活性来促进细胞凋亡。

另一个高度保守的miR-10家族也被证实参与细胞的增殖和凋亡。Yu等[37]研究发现，miR-10家族成员在就巢期和产蛋期的鹅卵泡中高度表达。方芳等[57]发现miR-10b能够靶向结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，)，通过抑制的表达来抑制山羊卵巢颗粒细胞的活性。Tu等[58]在探究miR-10家族成员对卵泡发育的调控作用时，发现miR-10a和miR-10b在卵泡成熟过程中表达量逐渐减少，但在卵泡闭锁时期表达量增加；通过进一步研究发现，miR-10a和miR-10b能通过抑制和TGF-β途径中的关键因子的表达来抑制卵泡中颗粒细胞的增殖，诱导颗粒细胞凋亡；此外，FSH和FSH介导因子—环腺苷一磷酸(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP)能够抑制颗粒细胞中miR-10a和miR-10b的表达，从而降低miR-10a和miR-10b对颗粒细胞增殖的抑制。研究证实FSH在就巢期禽类的卵巢中含量显著低于产蛋期[5,10,11]，因此推测就巢期FSH含量的降低减少了对miR-10a和miR-10b的抑制，导致卵泡颗粒细胞增殖受到抑制。

综上所述，miR-202、miR-320家族、miR-205家族和miR-10家族在调控就巢期禽类卵巢生理功能中发挥了重要作用。

3 参与就巢性调控的相关信号通路

禽类的就巢性是一个受多种因素调控的复杂性状，其中繁殖激素含量的改变和卵巢功能退化是就巢期禽类的典型特征。从产蛋期进入就巢期，该过程涉及多条信号通路的参与(表1)。大量的研究证实，参与禽类就巢性调控的基因主要富集于细胞周期、细胞增殖和凋亡通路。Liu等[7]利用全转录组技术比较分析就巢期和产蛋期鸡的卵巢组织，通过GO和KEGG富集分析，发现差异表达的基因主要富集于PI3K-Akt信号传导、cGMP-PKG信号传导、FoxO信号传导、细胞周期、Hippo信号传导、MAPK信号传导、细胞凋亡和TGF-β信号传导等途径；其中大部分通路参与调控细胞的增殖和凋亡。除上述的细胞增殖和凋亡通路外，部分差异表达的基因还富集在与繁殖相关的通路上。Xu等[35]通过Solexa测序技术筛选出大量的与繁殖和就巢性相关的miRNAs，通过对靶基因的功能进行富集分析，发现基因富集最多的通路是繁殖通路，包括TGF-β信号通路、GnRH信号通路和类固醇激素生物合成信号通路。

3.1 类固醇激素的生物合成

就巢期禽类的卵巢高度萎缩，颗粒细胞和膜细胞数量减少，导致卵泡内合成的类固醇激素的含量降低。雌二醇和孕酮是参与禽类就巢性调控的两种主要的类固醇激素，由卵泡的颗粒细胞和膜细胞合成，这一过程主要受FSH的调控。FSH可以通过FSH-cAMP-蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)通路调控颗粒细胞中类固醇激素的合成。FSH与膜上的G蛋白偶联受体结合，激活下游的腺苷酸环化酶和PKA信号转导途径，调控参与雌二醇和孕酮合成的基因转录水平，影响卵泡中类固醇激素的合成。Cui等[59]在体外培养的3T3-L1细胞中添加FSH，发现能够提高细胞中雌二醇的含量，同时检测细胞中胆固醇、孕酮含量和cAMP-PKA通路以及过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)途径中的相关基因的表达量，证实在体外培养的3T3-L1细胞中，FSH能够通过激活cAMP- PKA通路，活化下游基因与过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)的结合，促进胆固醇向雌激素的转化。此外，FSH还可以通过FSH-P38 MAPK-StAR/ P450arom通路调控颗粒细胞中类固醇激素的生成。Yu等[60]研究发现，FSH通过两条不同的途径诱导颗粒细胞中雌激素和孕酮的生成，FSH激活P38MAPK通路，P38MAPK激活下游的孤儿受体家族的肝脏受体同源物-1 (liver receptor homolog-1,)基因，调控芳香化酶家族的表达，进而影响颗粒细胞中雌激素的合成；此外，由FSH激活的P38MAPK途径能够诱导下游另一个孤儿受体基因(orphan receptor-1,)的活化，进而影响类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,)基因的转录水平，调控颗粒细胞中孕酮的合成。

FSH诱导的TGF-β信号通路也被证实参与颗粒细胞中类固醇激素生成的调控。Liang等[61]研究证实FSH能够协同通过Smad途径调控颗粒细胞中雌激素的合成；此外，还可以协同来调控的表达，最终影响颗粒细胞中雌激素的释放。Lai等[62]发现FSH也能够通过激活颗粒细胞中的，诱导钙调神经磷酸酶介导的去磷酸化，激活cAMP反应元件结合蛋白，调节转录共激活因子2 (CREB regulated transcription co­activator 2,)的活性，而则参与调节、和羟基δ5类固醇脱氢酶3β(hydroxy delta 5 steroid dehydrogenase 3 beta,)的表达，促进颗粒细胞中孕酮的产生。

叉头转录调节因子2 (forkhead transcriptional regulator 2,)是一种基因转录因子，在禽类卵泡中主要参与颗粒细胞功能的调控。有研究表明，FOXL2能够诱导颗粒细胞中雌激素的合成。Wang等[63]的研究发现，FOXL2通过两条途径激活芳香酶基因的转录，调控罗非鱼()卵巢中类固醇激素的合成，其中可以直接通过其叉头结构域与基因的启动子结合，激活的转录；此外，也可以通过叉头结构域与Ad4BP/SF-1的配体结构域结合，形成异二聚体，并增强Ad4BP/SF-1介导的转录。毛岩等[64]探究DNAJ同源亚家族B成员11 (DNAJ homolog subfamily B member 11,)与在调控小鼠卵泡颗粒细胞中雌激素合成中的互作关系，发现能够靶向结合基因，增强FOXL2蛋白的稳定性，促进下游诱导的的转录活性，从而增强颗粒细胞中雌二醇的合成。Li等[65]也证实在雌激素合成中发挥了重要的作用，敲除雌性罗非鱼基因后，罗非鱼体内的卵母细胞表现出不同程度的变性，血清雌二醇-17β水平和芳香酶基因表达显著降低；因此，推测可能通过调控芳香酶基因的表达来影响雌激素的合成。Folger等[66]发现可卡因和苯丙胺调节转录物(cocaine- and amphetamine-regulated transcript, CART)信号通路也参与了不同发育阶段卵泡颗粒细胞中雌激素的调控，抑制CART信号传导会影响发育后期的卵泡中雌二醇合成；此外，在颗粒细胞的体外培养中添加CART成熟肽，能够减少FSH刺激的体外培养颗粒细胞中雌二醇的产生。

3.2 细胞增殖与凋亡

众多转录组学的研究结果显示，在就巢期和产蛋期的禽类卵巢中差异表达的基因主要富集于细胞周期、细胞增殖和凋亡通路。这与就巢期禽类卵巢的形态学观测结果相符，与产蛋期相比，就巢期禽类的卵巢体积显著萎缩，卵巢表面无等级卵泡的发育。Yu等[37]对差异表达的miRNA靶基因进行通路富集分析，发现除了报道较多的繁殖通路显著富集外，在卵泡中还存在显著富集的细胞增殖和凋亡通路，如MAPK信号通路、细胞因子—细胞因子受体相互作用，以及卵泡发生中的Wnt信号通路等。Liu等[7]研究发现，就巢期萎缩卵巢中下调的基因主要富集在PI3K-Akt信号通路、ECM受体相互作用、Jak-STAT信号通路和TGF-β信号通路中，而在就巢期萎缩卵巢中上调的基因则主要富集于类胆碱突触、吞噬体、Notch信号通路和视黄醇代谢通路。

PI3K-Akt信号通路在调控细胞增殖、迁移、凋亡和代谢等多种生理活动中发挥着重要的作用。研究表明，PI3K-Akt通路参与调控卵巢和卵泡中细胞的增殖。高雪等[67]探究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,)对颗粒细胞增殖的影响，发现抑制基因的表达会降低PI3K、P-AKT蛋白的表达，进而抑制颗粒细胞的增殖，并诱导其发生凋亡。因此，推测可能是通过PI3K/AKT信号通路来发挥其调控颗粒细胞增殖和凋亡的功能。先前的研究也证实PI3K/AKT通路是转导FSH信号的关键途径。如Hunzicker-Dunn等[68]利用FSH刺激体外培养的大鼠颗粒细胞，并探究PKA和生长因子受体结合蛋白相关蛋白2 (growth factor receptor-bound protein-associated binding protein 2,)基因在卵巢颗粒细胞中对FSH刺激的PI3K/AKT信号传导途径的作用，发现FSH刺激细胞后，激活PKA和下游的胰岛素受体底物-1 (insulin receptor substrate-1,)、的表达；GAB2作为PKA的锚定蛋白，能够促进PKA与IRS-1复合物的形成，增强IRS1对下游PI3K/AKT信号途径的激活作用，最终起到促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强类固醇和蛋白质激素基因转录、翻译和启动颗粒细胞分化的作用。Law等[69]的研究充分阐明了FSH刺激的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)-cAMP- PKA-PP1/MYPT1-IGF/IGFIR/IRS1-PI3K/AKT通路在调控颗粒细胞增殖中的反应机制，利用FSH刺激体外培养的腔前颗粒细胞，发现FSH可以通过GPCR直接激活PKA和蛋白磷酸激酶1 (protein phosphatase 1,PP1)的表达；此外，激活的PKA还可以通过促进肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1 (myosin phosphatase targeting subunit 1, MYPT1)的磷酸化来进一步激活PP1；激活的PP1cβ/MYPT1能够促进下游IRS1丝氨酸多位点去磷酸化和IRS1 YXXM的磷酸化，进而激活PI3K/AKT信号途径，促进颗粒细胞的增殖。这种机制不仅存在于卵巢腔前颗粒细胞中，同样也存在于排卵前的颗粒细胞中。就巢期的禽类卵巢内，颗粒细胞数量锐减，FSH的含量也显著降低。因此，FSH诱导的PI3K/AKT信号途径受到抑制，最终导致颗粒细胞的增殖和类固醇的合成受到抑制。

TGF-β通路不仅参与卵巢颗粒细胞中类固醇激素的合成，同样也被证实参与调控卵巢内细胞的增殖和凋亡。TGF-β信号通路主要通过激活下游的接头蛋白SMADs和不同miRNAs的表达，参与卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡调控。Du等[70]探究在滤泡闭锁中的作用机制，发现TGF-β/SMAD4-miR- 143-FSHR信号途径在调控颗粒细胞凋亡中发挥重要的作用，激活TGF-β信号途径，能够促进下游的SMAD4接头蛋白的表达，SMAD4能够靶向结合miR-143，下调miR-143的表达，进而降低miR-143对基因的转录抑制作用，减少miR-143诱导的GC细胞凋亡。除上述在经典TGF-β通路中发挥正向调控作用的SMAD4蛋白外，SMAD7蛋白也能够通过负反馈调控的方式参与TGF-β信号通路对细胞周期的调控。Gao等[71]证实在体外培养的小鼠颗粒细胞中，、骨形态发生蛋白4 (bone morp­hogenetic protein 4,)和生长转化因子9 (growth differentiation factor 9,)基因能够促进的表达，而则可以通过与靶向结合，降低TGF-βR1-SMAD2/3信号传导的活性，负反馈调控TGF-β信号通路对细胞增殖的作用。近期的研究发现，能够通过调控的转录活性，调控TGF-β信号传导途径，增强猪颗粒细胞的凋亡；但miR-181b和miR-92a则可以靶向结合，减弱对TGF-β信号传导途径的调控作用，抑制GC凋亡[72,73]。

Notch信号通路在胞间信号传导和细胞形态发生中发挥重要的作用，主要是通过受体Notch1-4与DSL (Delta/Serrate/lag-2)蛋白结合，将信号传递给下游的螺旋-环-螺旋转录因子(helix-loop-helix trans­cription factors,), myc原癌基因家族(myc protooncogene family,)等信号分子，发挥调控细胞生理功能的作用。近期有研究表明，Notch信号通路在早期卵泡的发育和胚胎的形成中发挥着重要的作用，影响细胞的增殖，分化和凋亡。Irles等[74]发现Notch信号通路能够维持德国小蠊()的卵泡处于一种既不发育也不凋亡的稳定状态。Trombly等[75]探究Notch信号传导对原始卵泡形成的影响，发现及其配体基因和下游靶基因、等在新生小鼠的卵巢中表达，在体外卵巢培养系统中抑制Notch信号通路，发现卵巢上原始卵泡的百分比显着降低，而生殖细胞的百分比显着增加。Jing等[76]利用DAPT抑制山羊卵泡细胞中的Notch信号途径，显著降低了卵泡中颗粒细胞的数量，同时阻遏Notch信号途径也会降低芳香酶基因的表达，进而影响雌二醇的合成。同时还发现Notch信号通路主要是通过调节与细胞凋亡相关基因的表达，进而调控颗粒细胞的发育。此外，在近期的研究中也发现Notch信号通路协同P13K/ Akt、MAPK和ERK通路共同调控颗粒细胞的增殖、凋亡和分化。Prasasya等[77]发现锯齿状典型Notch配体1 (jagged canonical Notch ligand 1,)是小鼠卵巢中表达最多的Notch配体，敲除和免疫球蛋白κJ区域的重组信号结合蛋白基因(recombin­ation signal binding protein for immunog­lobulin kappa J region,)，会抑制颗粒细胞的分化，降低颗粒细胞中的类固醇合成因子和相关酶的表达量，影响类固醇的合成和分泌；而抑制的表达能够促进颗粒细胞的增殖。

4 结语与展望

禽类的就巢性是一种由多基因控制的低遗传力性状，主要受环境、内分泌和遗传等因素的影响，其中遗传因素是决定性因素。繁殖激素是诱导就巢行为产生的直接原因，其中PRL是调控就巢行为产生和维持的主要因素，因此和是繁殖相关激素基因中调控就巢性的主要候选基因，、、、、、和等基因通过调控和基因的表达来调控禽类就巢行为的产生和维持。转录组学的研究同样也证实了HPG轴相关激素及其基因在调控就巢行为中的重要作用；通过相关的转录组学研究筛选出了大量的与繁殖和就巢性相关的蛋白编码基因和miRNAs，并初步揭示了调控就巢行为的生物学通路，如MAPK信号传导、TGF-β信号传导、催产素信号传导、GnRH信号传导和雌激素信号传导等。虽然近几年在转录组水平上筛选出了大量的与就巢性相关的候选基因和通路，但这些候选基因之间的互作关系、miRNA对基因的调控方式以及调控就巢性状的具体分子机制还不清楚，关于禽类就巢性的基因组学和蛋白质组学的研究也未见报道。此外，目前关于禽类就巢性的转录组学研究主要局限在卵巢、卵泡和下丘脑这3种组织中，缺少对于PRL合成和释放的垂体组织的研究。因此，在以后的研究中需要对调控禽类繁殖的HPG轴上的相关组织器官进行全面的分析，利用体外和活体实验对筛选出来的新编码基因和非编码基因进行具体功能的探索，同时利用全基因组、转录组和蛋白质组等多组学联合分析以及高通量染色体构象捕获(high-througnput chromosome confor­mation capture, Hi-C)等新技术来进一步揭示调控就巢行为的具体分子机制。

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Genetic regulation of broodiness in poultry

Lingqian Yin, Jinshan Ran, Jingjing Li, Peng Ren, Xianxian Zhang, Yiping Liu

Broodiness is a behavior commonly occurring in the poultry industry, which is characterized by inappetence, egg-laying cessation and incubation. Different from laying fowls, the ovary and oviduct of broodiness fowls is degenerate. Broodiness is a low heritability trait, which is controlled by multiple genes in autosomes and influenced by three factors, including environment, endocrine and genetics. In addition to the observation of behavioral characteristics, the current research of broodiness focuses on evaluating the genetic mode, endocrine factors, nesting candidate genes and their polymorphisms in poultry. Given the rapid development of high-throughput sequencing, the joint analyses of genomics, transcriptomics and proteomics have been used to screen out the candidate genes, pathways and molecular mechanism of broodiness. In this review, we summarize the candidate genes, microRNAs and pathways involved in broodiness to provide a reference for further research on poultry broodiness.

poultry; broodiness; reproductive hormone; candidate gene; microRNA; signaling pathway

2018-11-21;

2019-03-20

四川省育种攻关项目(编号：2016NYZ0043)和四川省省院省校科技合作研发项目(编号：2017JZ0033)资助[Supported by the Open Fund of Farm Animal Genetic Resources Exploration (No. 2016NYZ0043) and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province (No. 2017JZ0033)]

尹玲倩，硕士研究生，专业方向：家禽遗传育种与繁殖。E-mail: 1061795429@qq.com

刘益平，博士，教授，研究方向：家禽遗传育种与繁殖。E-mail: liuyp578@163.com

10.16288/j.yczz.18-316

2019/3/22 9:12:26

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190322.0911.002.html

(责任编委: 李辉)