青海西北部沙棘立木腐朽病初报

徐铭蔚，季晓红，赵俊，周德明

(1.中南林业科技大学林学院经济林培育与保护教育部重点实验室，森林有害生物防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2.北京林业大学微生物研究所，北京 100083；3.国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站，林业有害生物监测预警国家林业和草原局重点实验室，辽宁 沈阳 110034)

沙棘Hippophae rhamnoides是中国三北地区广泛分布的一种落叶灌木，其根系发达，具有着生固氮根瘤的特性。此外，沙棘极具耐旱、耐瘠薄、耐盐碱的特性，因此被作为防风固沙、保水保土、改良土壤的优良树种，在我国干旱地区水土保持和生态恢复中具有重要作用。沙棘果实内含有极丰富的脂肪、蛋白质、糖类、盐类和维生素等营养成分，已经开发出沙棘果汁、沙棘醋和沙棘果酱等产品；此外，沙棘果实还具有活血散淤、化痰宽胸、补脾健胃、生津止渴、清热止泻之效，同时对多种疾病都有一定的治疗作用。目前中国沙棘林分总面积已达220 万hm2，具有重要的生态、经济、社会效益，但是近年来沙棘木材腐朽病害发生逐年扩大。

国内最早报道沙棘木材腐朽病的病原菌为稀木层孔菌Phellinus robustus(P.Karst.)Bourdot ＆Galzin[1-2]，但后来研究发现稀木层孔菌只侵染栎属Quercus树木的主干，不侵染沙棘；在欧洲，生长在沙棘上的病原腐朽菌为沙棘木层孔菌Phellinus hippophaeicolaH.Jahn[3]。因此中国西藏地区沙棘腐朽病原菌也曾鉴定为沙棘木层孔菌Phellinus hippophaeicola[4-5]和沙棘嗜蓝孢孔菌Fomitiporia hippophaëicola(H.Jahn)Fiasson ＆ Niemelä[6]。但是随着研究技术和手段的提高，特别是分子生物学技术的应用，发现造成中国沙棘腐朽病害的病原菌与欧洲的不同[7]，目前世界范围内已经发现4 种病原菌[7-9]，即沙棘嗜蓝孢孔菌Fomitiporiahippopha-eicola，罗布林卡蓝孢孔菌Fomitiporia norbulingkaB.K.Cui ＆Hong Chen，拟沙棘嗜蓝孢孔菌Fomitiporia subhippophaëicolaB.K.Cui ＆ H.Chen 和鼠李嗜蓝孢孔菌Fomitiporia rhamnoidesT.Z.Liu ＆ F.Wu。

2018年夏季我们在青海省门源县仙米森林公园调查森林病害时，发现公园内的沙棘腐朽病害发生严重。为明确青海西北部沙棘立木腐朽病的病原菌，笔者对病原菌子实体进行采集和分离，经对样品的分子序列进行系统发育分析，确认该地区沙棘腐朽病的病原菌为鼠李嗜蓝孢孔菌Fomitiporia rhamnoides。鉴于国内尚无对该病原菌的中文报道，根据已发表的英文文献[9]描述了该病原菌的形态。

1 材料和方法

1.1 病原菌子实体采集 2018年在青海省门源县仙米森林公园沙棘腐朽病发病区进行样品采集，共采集3个样品，编号分别为ZHAO20180801、ZHAO 20180802 和 ZHAO20180803。

1.2 样品DNA 提取 采用快速无毒试剂盒，取1.1 中干净样本约20～60 mg 研磨破碎后，编号备用。用CTAB 植物基因组DNA 快速提取试剂盒提取DNA，具体步骤如下:

1)准备离心管，每号标本1.5 mL 灭菌离心管3份，吸附柱AC 管1 份，均编号；

2)取400 μL 裂解液PL 分别加到编号的离心管中备用；

3)液氮研磨样品，然后加到相应的离心管中，65 ℃水浴30 min 或更长时间；

4)加400 μL 氯仿异戊醇(氯仿和异戊醇配比为 24∶1)，12 000 r/min 离心 5 min；

5)预先在另1 组离心管中加入450 μL 的结合液PQ，取300 μL 上清液加入1个添加 PQ 的离心管中，混匀转入AC 管中；

6)12 000 r/min 离心 30 s，弃废液；

7)添加500 μL 抑制物去除液 IR，12 000 r/min离心30 s，弃废液；

8)添加 500 μL 的漂洗液 WB，12 000 r/min 离心30 s，弃废液；

9)再离心2 min，将吸附柱AC 转入1个干净的离心管中，自然晾干，约10 min 即可；

10)加入60～100 μL 的 Elution Buffer，室温静置3～5 min，12 000 r/min 离心 30 s，收集 DNA 备用。

1.3 样品ITS 和nLSU 片段扩增及测序

1.3.1 ITS 片段PCR 反应程序 95 ℃预变性3 min，94 ℃变性 40 S，54 ℃复性 45 S，72 ℃延伸 1 min，35个循环后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保温。ITS 片段使用的引物为 ITS1(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′)和 ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。

1.3.2 nLSU 片段 PCR 反应程序 94 ℃预变性1 min，94 ℃ 变性 30 s，50 ℃ 复性 1 min，72 ℃ 延伸1.5 min，35个循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。nLSU片段使用的引物为LR0R(5′-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3′)和 LR7(5′-TAC TAC CAC CAA GAT CT-3′)。

ITS 和 nLSU 的 PCR 反应体系(30 μL):2 ×EasyTaq PCR SuperMix，15 μL；Primer1 (10 μmol/L)(正向)，1 μL；Primer2(10 μmol/L)(反向)，1 μL；Template DNA(75 ng/μL)，1 μL；ddH2O，12 μL。

1.3.3 测序 将所得样品送至测序公司进行测序，将这些新获得的序列提交到GeneBank 数据库。

1.4 系统发育分析 将nLSU 基因片段正反向序列拼接，用BioEdit 7.0.1[10]对所得序列进行比对和编辑，用 ClustalX 2.0[11]转化 Faster 序列文件为NEXUS 和 PHYLIP 格式文件[12]；用Phellinus uncisetus为ITS +nLSU 系统发育树的外群[13]；最大简约法(MP)采用 win-paup4b10 构建系统发育树[14]，最大似然法(ML)采用raxmlGUI 1.2 构建系统发育树[15-16]；用 GTR+I+G 模型 jModelTest 2.1.4筛选最佳模型[17-18]，用 MrBayes 3.1.2 贝叶斯法(BI)构建系统发育树[19]，GTR 模型作为最佳替代模型；系统发育树用 Tree View 读取并保存[20]。最大似然和最大简约支持概率(BS)不小于50%，贝叶斯后置概率(BPP)不小于0.90，则节点支持率可靠[12]。

2 结果与分析

2.1 测序结果 样品 ZHAO20180801、ZHAO 20180802 和 ZHAO20180803 的 ITS/LSU 序列分别为 MK424367/MK430426，MK424368/MK430427和MK424369/MK430428。对这些序列进行系统发育分析，确认该地区沙棘腐朽病害的病原菌为鼠李嗜蓝孢孔菌Fomitiporia rhamnoides(图1)。鉴于国内只在河北省对该种进行过种类报道，并无该菌引起林木病害的报道[9]；在青海西北部尚无该真菌及其引起沙棘心材腐朽病害的报道[7-9]，因此本文是我国首次对该菌引起沙棘心材腐朽病害的研究报道，也是鼠李嗜蓝孢孔菌在我国西北部的首次报道。

图1 鼠李嗜蓝孢孔菌的系统发育位置

2.2 形态描述 鼠李嗜蓝孢孔菌Fomitiporia rhamnoidesT.Z.Liu ＆ F.Wu，in Liu，Chen，Han ＆Wu，MycoKeys 36:37(2018)

担子果 多年生，通常生长在树干或树枝上，无柄盖形，单生或数个覆瓦状叠生，新鲜时木栓质，无特殊气味，干后硬木质，干后质量中度变轻。菌盖半圆形或蹄形，外伸可达8 cm，宽可达10 cm，基部厚5 cm。菌盖表面黄褐色、灰褐色至黑褐色，具同心环沟，幼期被绒毛或茸毛，后期变光滑，随年龄增加逐渐龟裂；边缘钝。孔口表面新鲜时灰黄至黄褐色，干后橘黄色至黄褐色，具折光反应；不育边缘薄，黄褐色，宽可达3 mm；孔口圆形，每毫米11～13个；孔口边缘厚，全缘。菌肉黄褐色，具环区，硬木质，厚可达2 cm。菌管灰褐色，比菌肉颜色浅，硬木栓质至脆质，分层不明显，长可达3 cm。(图2)。

图2 鼠李嗜蓝孢孔菌的子实体

菌丝结构 菌丝系统二体系；生殖菌丝具简单分隔；所有菌丝在Melzer 和棉兰试剂中无变色反应；在KOH 试剂中组织颜色变黑。

菌肉 生殖菌丝无色至淡黄色，薄壁或稍厚壁，偶尔分枝，频繁分隔，直径为3～4 μm；骨架菌丝黄褐色，厚壁，具宽的内腔，不分枝，偶尔分隔，平直，规则排列，直径为 4.5～6 μm。

菌管 生殖菌丝无色至浅黄色，薄壁，偶尔分枝，频繁分隔，直径为2～3 μm；骨架菌丝占多数，黄褐色，厚壁，具宽内腔，不分枝，偶尔分隔，平直，沿菌管平行排列，直径为2.5～4 μm。子实层中无刚毛；拟囊状体中部腹鼓，无色，薄壁，大小为(12～20)μm ×(3～6)μm；担子近球形至桶形，具 4 小梗，基部有一横隔膜，大小为(8～16)μm × (6～10)μm；拟担子在子实层中占多数，形状与担子相似，大小为(8～15)μm ×(6～9)μm；菱形或不规则型结晶体大量存在于子实层中。

孢子 担孢子球形，无色，光滑，厚壁，在Melzer试剂中呈拟糊精反应，在棉兰试剂中其壁呈嗜兰反应，大小为(6～7.5)μm ×(5～6.5)μm，平均长为6.69 μm，平均宽为6.20 μm，长宽比为1.08。

3 结论和讨论

首次报道鼠李嗜蓝孢孔菌在我国青海西北部造成心材白色腐朽，该菌过去作为分类学种类仅在我国河北有报道，且未说明该菌是否为病原菌。沙棘立木腐朽病主要发生在沙棘成熟林分内，病原菌通过沙棘伤口侵染，最后风折导致沙棘死亡。

鼠李嗜蓝孢孔菌与沙棘嗜蓝孢孔菌、罗布林卡蓝孢孔菌和拟沙棘嗜蓝孢孔菌都生长在沙棘树上，且都引起心材白色腐朽。沙棘嗜蓝孢孔菌仅分布在欧洲，其孔口较大(每毫米5～7个)，其他3 种的孔口较小(每毫米8～13个)。拟沙棘嗜蓝孢孔菌分布在西藏林芝地区，其主要特征是担子果平伏反转，而其他3 种的菌盖为无柄盖形。罗布林卡蓝孢孔菌的主要特征是子实层无拟囊状体，而其他3 种均具有拟囊状体。鼠李嗜蓝孢孔菌的主要特征是孔口最小(每毫米11～13个)，且具有大量的菱形或不规则型结晶体存在于子实层中，而其他3 种的孔口为每毫米5～10个，且在子实层中无菱形或不规则型结晶体存在。因此从形态上也能区分这个4 种病原菌。此外，最重要的是这4 种病原菌的分子序列不同，因此从序列上很容易对比而区分。

鼠李嗜蓝孢孔菌在我国西北部的子实体比在河北地区的稍大，孔口较浅，但分子序列与模式材料的一致，两者在在系统发育树上聚在同一分支，且获得高支持率，因此青海西北部沙棘腐朽病的病原是鼠李嗜蓝孢孔菌。该菌在青海西北部沙棘林分造成严重病害，我们所调查的林分发病率高达60%以上，沙棘单株树木上可产生多个子实体，受害树木在初期影响生长，后期心材严重腐朽，通常风折死亡，但也可直接造成沙棘死亡。