异甘草素预处理对老龄大鼠术后认知功能及BDNF通路的影响

吴艳琼 许先成 孙艳玲 昌睿杰 李清

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD）是老年患者术后常见的中枢神经系统并发症，主要表现为焦虑、人格改变、学习记忆受损等[1-2]。POCD严重影响患者术后生活质量，甚至增加远期病死率[3]，且确切发病机制尚不清楚，如何防止也缺乏有效手段。近年来研究发现，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其受体酪氨酸激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)信号通路能调控神经元增殖与分化、突触可塑性、神经递质释放等，在丙泊酚所致POCD中扮演重要角色[4]。异甘草素（lsoliquiritigenin，ISL）是从甘草中提取的一种黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化[5]、抗神经元凋亡[6]、改善学习记忆等作用[7]。本研究旨在观察ISL预处理对老龄大鼠术后认知功能及BDNF通路的影响，以进一步探讨该疾病的发病机制和防治方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 SPF级健康雄性老龄SD大鼠54 只，18～20 月龄，体重 500～600g，均由湖北医药学院动物实验中心提供，并经湖北医药学院动物伦理委员会批准。采用随机数字表法将其分为对照组（C组）、手术组（S组）、ISL+手术组（P组），每组18只。

1.2 试剂与设备 ISL由湖北医药学院药学部提供（天津马克生物技术有限公司产品，批号:GC-20120203，规格：20mg）；Western blot试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号:G2003）；BDNF、TrkB 抗体（中国 biosharp公司，批号:BL003A）；肌动蛋白（β-actin）抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号:GB1101）；Morris水迷宫设备（上海欣软科技有限公司，型号：XR-XM101）。

1.3 Morris水迷宫实验 参照文献[8]，3组大鼠于术前5d进定位航行实验，训练4次/d，将水迷宫宫体均分为4个象限，水温维持25℃左右，将逃生平台固定于第1象限，位于水下0.7cm处，保持平台周围参照物恒定，通过悬于水池上方摄像头对大鼠活动进行图像分析处理。将大鼠置于平台上适应30s，之后将大鼠从4个象限随机放入水中，记录大鼠入水到站于平台上所需时间，即为逃避潜伏期；记录大鼠从入水至找到平台游过的路线长度为总路程，即为游泳距离。若大鼠60s仍未找到平台，则将其引至平台，在平台停留10s，然后进行下一次训练。取术前5d测试结果的平均值作为术前值，分别于术后 1、3、7d再次行水迷宫实验，记录大鼠逃避潜伏期和游泳距离。

1.4 动物模型制备 采用10%水合氯醛腹腔注射（0.3ml/100g）麻醉大鼠，在其失去翻正反射后仰卧位固定大鼠，清洁消毒腹部皮肤，于肋下0.5cm处沿腹中线作一约3cm左右的纵向切口，每5min进行一次腹腔探查术（包括肝、胃、小肠、大肠），总手术时间20min，探查完成后关闭腹腔[9]。C组麻醉后不进行手术，S、P组行剖腹探查术；P组于手术前连续5d给予15mg/kg的ISL灌胃（0.5g ISL溶于0.9%氯化钠溶液100ml），C、S组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。

1.5 Western blot法检测海马区BDNF、TrkB蛋白表达 分别于术后 1、3、7d水迷宫实验结束后，采用随机数字表法取其中6只大鼠处死，分离海马组织，将脑组织进行匀浆研磨；加入蛋白裂解液，充分裂解离心后取上清液进行SDS-PAGE电泳；电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上，将膜转至含封闭液的平皿中，封闭2h；加入BDNF及TrkB一抗，室温孵育2h；TBST缓冲液洗膜3次、每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2h；洗膜3次、每次5min，将膜置入显影液，充分接触并显影，采用成像分析系统对显影胶片进行分析与扫描。以目的蛋白条带与内参（β-actin）条带吸光度值的比值反映BDNF、TrkB蛋白的相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；水迷宫实验数据术后各时点比较采用重复测量数据的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠各时点逃避潜伏期比较 与术前比较，S、P组大鼠术后各时点逃避潜伏期均明显延长（均P＜0.01）；与C组比较，S、P组术后各时点逃避潜伏期均明显延长（均P＜0.01）；与S组比较，P组术后各时点逃避潜伏期均明显缩短，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 1。

表1 3组大鼠各时点逃避潜伏期比较（s）

2.2 3组大鼠各时点游泳距离比较 3组大鼠术前游泳距离比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与术前比较，S、P组大鼠术后各时点游泳距离明显延长；与C组比较，S、P组大鼠术后各时点游泳距离明显延长；与S组比较，P组大鼠术后各时点游泳距离明显缩短，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

2.3 BDNF、TrkB蛋白表达量比较 与C组比较,术后各时点S、P组BDNF、TrkB蛋白表达量降低（P＜0.05）；与S组比较，术后各时点P组BDNF、TrkB蛋白表达量增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3、图 1。

表2 3组大鼠各时点游泳距离比较（cm）

表3 3组大鼠各时点海马区BDNF、TrkB蛋白表达量比较

图1 3组大鼠各时点海马区BDNF、TrkB蛋白表达的电泳图（n=6）

3 讨论

以往对POCD的相关研究多集中于心脏手术，近年来研究发现，在非心脏手术患者中POCD的发病率高达40%～50%，随着人口老龄化的增加，POCD的发生率亦随之增高，因此预防及治疗POCD具有重要的临床意义。本实验通过剖腹探查术建立伤害性刺激模型，结果表明与C组比较，S、P组小鼠术后认知功能明显降低，证实手术引起的伤害性刺激参与POCD的发生。

现代药理表明，甘草除具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节等作用外，还具有显著的神经保护作用[10]。ISL为甘草中有效成分之一，在神经保护方面主要有抗缺血再灌注损伤[11]、抗氧化[12]、改善学习及记忆能力等作用[13]。詹春等[14]发现ISL可改善小鼠脑缺血再灌注损伤所致学习记忆障碍、改善异常脑血流及脑组织能量代谢,在脑缺血再灌注脑损伤中发挥保护作用。因此本实验通过大鼠相关行为学指标检测，深入探讨ISL预处理对于大鼠术后认知功能的影响。

Morris水迷宫常作为神经退行性疾病动物模型研究方法之一，用于评估学习认知和空间记忆等行为学，且检测老年动物认知功能减低较为敏感[15]。本研究于术前5d进行定位航行实验，显示各组逃避潜伏期及游泳距离差异无统计学意义，证实在给予ISL预处理后，对于正常大鼠认知能力未见明显影响。术后1、3、7d，与S组比较，P组逃避潜伏期和游泳距离明显缩短，表明ISL预处理对于术后大鼠认知功能下降有一定的改善作用。

BDNF是由神经元、神经胶质细胞等多种细胞合成和分泌的神经营养蛋白,它对参与情感和认知功能的关键脑区回路中的神经元的生存、生长和维持起着至关重要的作用[16]。BDNF与细胞膜上的TrkB受体特异性结合后,可以通过激活下游信号分子促进促进神经元增殖与凋亡等,参与认知功能的调节[17]。研究发现敲除BDNF基因的小鼠，其TrkB蛋白表达明显下降，小鼠学习能力出现障碍[18]。BDNF信号通路参与了多种神经系统疾病中认知功能障碍的发生与发展,且使用TrkB激动剂激活BDNF-TrkB信号通路后,认知功能得到改善。已被证实BDNF的表达受伤害性刺激影响，炎症因子（IL-6、IL-1β等）可以抑制神经细胞BDNF的合成和表达。阿尔兹海默症模型中证实，ISL能有效抑制上述炎性因子的生成，上调BDNF表达[19]。因此本实验预测ISL可通过抑制炎症作用调控BDNF-TrkB信号通路，改善术后认知功能。实验结果证实了该假说，通过对海马区BDNF、TrkB蛋白含量进行了相关检测，显示与S组比较，P组大鼠术后各时点海马区BDNF、TrkB蛋白表达水平明显增加，提示ISL能够有效增强BDNF-TrkB信号通路的活化，改善老龄大鼠术后的认知功能。

本实验仅对创伤性刺激所致的POCD进行了相关研究，未进行BDNF-TrkB信号通路上、下游基因检测，也未进行术后更长时间的认知功能的评估，这可在今后的研究中进一步探讨。