高效液相色谱法测定天麻中7种成分含量

李俊婕，刁飞燕，胡德福，姜岩，于向红，李启艳

(1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2.国家中药品种保护审评委员会，北京 100070)

天麻是我国常用名贵中药材之一，具有两千多年的药用历史， 称为“治风之神药”。近代的天麻炮制主要是麻切制、蒸制等法[1]。《中国药典》中描述天麻为兰科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥块茎，立冬后至次年清明前采挖，立即洗净，蒸透，敞开低温干燥。具有平抑肝阳、祛风通络的功效[2]。天麻主产于云南、贵州、四川、陕西及河南等省[3]。现代研究表明，天麻具有镇静安眠、抗惊厥、增智健脑、延缓衰老等保健作用，张建军[4]通过试验证实天麻素及其苷元是主要的活性成分。文献有关天麻化学成分的报道主要包括酚类化合物及其苷类、甾醇及有机酸类、多糖类、微量的维生素A类物质、AmD2-9、AmD2-20(新型生物碱) 多种氨基酸、微量元素等[5-6]。目前关于天麻质量控制的相关标准还主要是天麻素和对羟基苯甲醇两个组分的测定，关于天麻化学成分含量测定的报道集中在天麻素、对羟基苯甲醇、天麻多糖、微量元素测定和其中一两种巴利森苷的测定等方面[7-8]。刘玉红等[9]建立了测定天麻药材中游离天麻素和总天麻素的方法;程芬等[10]通过测定比较栽培天麻与野生天麻中天麻素、氨基酸、总黄酮的量，来选择天麻的最佳栽培方式;本试验所建立的方法对天麻药理活性突出的7种组分同时进行测定，并对线性关系、精密度、重复性、加标回收率等一些方法学试验进行考察。试验结果表明，该方法可以准确地测定天麻中腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷 A、巴利森苷 B、巴利森苷 C、巴利森苷E 7种成分含量，为更好地控制天麻的质量提供参考依据。

1 试样及试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，PDA 检测器和Empower3 工作站(美国Waters公司)；Milli-Q超纯水机(密理博公司)；Mettler Toledo MS105DU分析天平(十万分之一，梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂、样品 天麻素(批号：11807-201620)、对羟基苯甲醇(批号：11970-201702)、腺苷(批号：11879-201703)对照品由中国食品药品检定研究院提供；巴利森苷 A(批号: P10O7F22270)、巴利森苷 B(批号: P11J7F17626)、巴利森苷 C(批号:P11J7F17625)、巴利森苷 E(批号: P10J8F28472)由上海源叶生物技术有限公司提供。乙腈(HPLC 级，德国Merck 公司)，其他试剂均为分析纯。本次起草共收集到保健食品原料天麻25批，样品信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：220 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL流速1.0 mL·min-1；流动相A为0.1%磷酸溶液，B 为甲醇；梯度洗脱程序：0～20 min，95%A；20～55 min，95%A→60%A；55～60 min，60%A→50%A；55～60 min，50%A→95%A；65～70 min，95%A。

2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过 3 号筛)约2 g(精确至0.001 g)，置于25 mL容量瓶中，加入20 mL 60%甲醇，称定质量，涡旋混匀1 min，超声提取40 min(40 ℃)，冷却，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，混匀，静置，取适量上清液过0.45 μm滤膜，取续滤液，备用。

2.3 系列标准溶液配制 精密称定各对照品适量，加 10%甲醇水配制成含腺苷 2.178 0 mg·mL-1、天麻素 2.948 1 mg·mL-1、对羟基苯甲醇 2.763 3 mg·mL-1、巴利森苷 A 1.978 0 mg·mL-1、巴利森苷 B 2.536 6 mg·mL-1、巴利森苷 C 2.009 1 mg·mL-1、巴利森苷 E 2.632 6 mg·mL-1的混合对照品溶液。准确量取混合对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，置10 mL量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，摇匀，制成系列混合标准溶液。

2.4 线性关系考察 取系列混合标准溶液，按照色谱条件依次进样分析，以质量浓度(mg·L-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

结果表明7种组分质量浓度在表中的范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续6次测定，记录各组分峰面积，计算腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E7种组分峰面积的RSD分别为1.1%、0.87%、0.89%、0.91%、0.97%、1.71%、1.57%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验 按“2.2”项下制备同一批号天麻的供试品溶液6份进行测定，记录峰面积，根据当日的随行标准曲线计算7种组分含量，其RSD分别为1.7%、1.9%、1.2%、1.6%、1.5%、1.8%、1.7%，表明该方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验 取天麻样品0.5 g，精密称定，分别加入7种相应组分，制备6份加标样品，按“2.2”项下方法制备加标样品待测溶液进行分析，根据当日的随行标准曲线，分别计算加标样品的测得量，求得回收率。

表3 加标回收率(n=6)

2.8 系统适用性试验 考察在本文色谱条件下，对天麻样品和对照品溶液进行测定。结果显示，7种组分均能达到基线分离，且分离度大于1.5，结果见图1。

A.对照品溶液；B.样品图1 天麻的对照品和样品图谱

2.9 样品测定结果 按上述试验方法对25批天麻样品和对照品溶液进行测定，记录峰面积，按标准曲线法定量，结果如表4。

3 讨论与结论

本试验考察了回流提取法、超声提取法两种提取方法，同时比较了甲醇、乙醇以不同浓度提取，发现60%甲醇涡旋后超声提取不仅简便快速而且提取效果最佳，7种组分峰面积最大，提取最完全。在提取时间方面分别考察了超声提取30、40、50 min，发现提取40 min 7组分面积和提取50 min基本相当，但是提取30 min面积相对小些。故本试验最终选择采用涡旋后用60%甲醇超声提取40 min的方法对样品进行前处理。在流动相考察方面对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水3 个流动相进行了考察，发现甲醇-0.1%磷酸水水作为流动相进行梯度洗脱各色谱峰分离度较好，7组分含量在检测波长 220 nm 检测条件下，可实现完全分离。

表4 样品中含量测定结果(%)

本文建立了采用HPLC法同时测定天麻中 7 种化学成分的含量，该方法前处理简单，采用梯度洗脱各成分分离度较好，测定灵敏度高，线性关系、准确度和精密度等均满足测定要求，本方法为天麻的全面质量控制提供参考依据。