许 倩,刘良国,黄文轩,林青青,邓 勇,吴 丹,杨品红
(1.湖南文理学院生命与环境科学学院/水产高效健康生产湖南省协同创新中心/环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室/动物学湖南省高校重点实验室,湖南 常德 415000;2.中南大学生命科学学院,长沙 410000)
大鳍鳠Mystus macropterus 属鲇形目Siluriformes鲿科Bagridae 鳠属Mystus,俗称石扁头、石胡子,主要分布在长江中、上游水域,是一种喜流水环境生活的底栖经济鱼类[1]。由于其营养丰富、肉味鲜美、无肌间刺,具有较高的食用价值,因而市场需求量大,大鳍鱯资源量呈现明显减少的趋势。同时,随着长江干支流水系大量水利水电工程的修建,河流的水文生境发生变化,极大地改变了大鳍鱯的生活环境,加之大坝阻隔可能导致的大鳍鱯生殖隔离,都可能使大鳍鱯种群的遗传结构发生改变。因此,为了更好地保护和利用长江水系这一特有的鱼类资源,开展其种群的遗传多样性研究具有较大的实际意义。近年来,关于大鳍鱯的遗传多样性研究,仅见周丽[2]对长江水系4 个不同江段(合川、广元、岳阳和金口)大鳍鱯进行过遗传多样性的RAPD 分析。 五强溪水库是长江中游支流——洞庭湖水系沅水干流上的最大水电工程,水库最大坝高85.83 m,正常蓄水位108 m,水库面积170 km2,干流回水长度150.2 km[3],坝址多年平均流量2 040 m3/s,年径流量643 亿m3。库区主要支流有酉水、武水和辰水,沿岸分布沅陵、泸溪和辰溪3 个县城和20 多个乡镇。 五强溪水库从1994年建成至今已有二十多年,开展水库大鳍鱯种群遗传多样性研究,对于进一步理解水电开发对鱼类遗传多样性的影响,以及保护与合理利用大鳍鱯这一名贵的野生经济鱼类资源具有非常重要的意义。
简单序列重复区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)扩增多态性作为近年来广泛使用的新型分子标记技术,具体检测样本量大,引物通用性强,操作简单,重复稳定性好及多态性高等优点,因而在群体遗传多样性分析、种质保护、亲缘关系鉴定、系统演化等方面广泛应用[4-8]。利用ISSR 分子标记技术对鱼类的遗传多样性及群体间的遗传差异进行研究,已见诸多成功报道[9-13]。 本研究采用ISSR 分子标记技术,对洞庭湖水系沅水五强溪水库的30 个大鳍鱯群体样本进行遗传多样性分析,旨在为水电开发影响下的大鳍鳠鱼类资源保护与可持续利用提供数据参考。
试验所用野生大鳍鳠活体样本分别采自洞庭湖水系沅水五强溪水库沅陵(E 110.39,N 28.46)、泸溪(E110.73,N28.29)和辰溪(E110.18,N28.02)江段,各江段随机选取10 尾生长状况良好的大鳍鱯标本(沅陵、 泸溪、 辰溪江段编号分别为1-10、11-20、21-30),30 尾样本分别剪其背部肌肉,用95%乙醇保存备用。
每个样品取1.0 g 肌肉提取基因组DNA,按照常规的酚-氯仿抽提步骤进行。 将提取后的DNA 通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量,用紫外分光光度计测定浓度和纯度,调整浓度至40 ng/μL,4 ℃保存备用。
试验选用的8 条ISSR 引物是由加拿大British Columbia 大学公布的ISSR 引物序列,委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
PCR 反应程序设定:94 ℃3 min,95 ℃1 min,52 ℃1 min,72 ℃1.5 min,进行40 个循环,最后72 ℃延伸10 min。
PCR 反应体系总体积为25 μL,其中40 ng/μL DNA 模板2.0 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,10 μmol/L ISSR 引物1.0 μL,Taq DNA polymease 1.0 μL(1 U/μL),2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,无菌水补充至25 μL。PCR 扩增产物经4%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(50 W 恒功率2.5 h),经ABI PRISM 377 测序仪扫描,得到电泳图,并以50~1 000 bp 标准分子质量进行对照。
测序仪扫描所得的电泳图用GENESCAN3.1 软件打开,并进行数据统计,使用EXCEL 软件对保存为XLS 格式的结果构建由“1”和“0”组成的原始二元数据矩阵,其中1 / 0 分别代表扩增片段的有或无。 利用Popgene1.32 软件进行位点总数和多态位点数统计,并计算出多态位点比率。
根据M.Lynch[14]的方法计算群体内、群体间的遗传相似指数和遗传距离:两个体间的遗传相似指数Sxy=2Nxy/(Nx+Ny),其中Nxy 表示个体x 和y 之间共有的DNA 扩增片段数,Nx 和Ny 分别是个体x和y 的DNA 扩增片段数。 群体内的遗传相似指数S为群体内所有的两个体间遗传相似指数的平均值,群体内的遗传距离D=1-S。
最后根据30 个个体间的遗传距离,使用MEGA4 软件包中UPGMA 方法绘制聚类分析树状图。
本试验所采用的8 个ISSR 引物扩增条带稳定、清晰,在30 尾大鳍鳠样本中共检测出1 162 个扩增位点,其中多态位点数占1 141 个,多态位点比例为98.19%,片段大小在50~1 000 bp 之间(图1)。 每个引物检测出的位点数106~265 个不等,每个引物的多态位点数102~263 个不等,不同引物扩增出的多态位点比例均在95%以上(表1)。
利用相关数据统计软件计算得到30 个大鳍鱯个体间的遗传相似指数在0.871~0.916 之间(表略),平均遗传相似指数为0.887;根据个体间的遗传相似指数,计算出个体间的遗传距离在0.084~0.129 之间(表2),平均遗传距离为0.113。
图1 大鳍鱯群体的ISSR 扩增图谱Figure 1 The ISSR amplified results for the 30 individuals of M.macropterus
表1 ISSR 引物在大鳍 鳠群体中检测的多态位点数及多态位点比例Table 1 Number of polymorphic loci and the percentage in the population of M.macropterus with a single primer by ISSR analysis
根据大鳍鱯群体共30 尾个体之间的遗传距离数据(表2),采用MEGA 软件包中的UPGMA 方法进行聚类分析,得到沅水五强溪水库大鳍鱯群体的UPGMA 分支树状图(图2)。 从分支树状图可见,30个大鳍鳠样本不以3 个采样江段而分别聚类,主要聚类成为两个群体。 其中样本1、27 聚类成1 个群体,其他28 尾个体聚类成另一个群体。在28 尾个体聚成的群体中又可分为多个小的类群。 聚类结果表明,大鳍鱯群体内遗传差异明显,从聚类图可见,洞庭湖水系沅水五强溪水库的大鳍鱯至少存在两个种群的遗传分化。
生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据,是物种适应多变的环境条件、维持长期生存和进化的遗传基础。 对种群遗传多样性的认识对于种质鉴定、 资源保护和亲本选择具有重要的意义[15]。 种群的多态性位点比率能够很好的反映物种的遗传多样性。 本试验对五强溪大坝阻隔背景下的水库大鳍鳠种群遗传结构及遗传多样性状况进行研究,在30 个样本中共检测出1 162 个扩增位点,其中多态位点数占1 141 个,多态位点比率为98.19%,不同引物扩增出的多态位点比率均在95%以上。 而周丽[2]采用RAPD 分子标记方法,对长江合川、广元、 岳阳和金口4 个江段大鳍鳠的遗传多样性进行研究,总共检测出139 个位点,其中多态位点101个,多态位点百分率为72.66%。 五强溪水库大鳍鳠群体的多态位点比率远高于长江干流4 个江段的大鳍鳠群体,这一方面可能与所采用的分子标记不同有关,ISSR 分子标记具有比RAPD 标记更高的分辨率,检测出的多态位点数多,因而多态位点百分率高; 另一方面,也可能与五强溪水库的生境变化相关,水库大坝建成后,水位上升,分支河汊增多,大鳍鳠从类似静水湖泊的河流主干游向不同的分支河汊或支流,在不同的分支河汊或支流生境下,大鳍鱯呈现出丰富的遗传多态性。 五强溪水库大鳍鳠的遗传多态性,反映出其具有较好的适应不同环境的能力,有利于大鳍鱯种群的生存与繁衍。
根据五强溪水库大鳍鳠群体不同个体间的遗传距离,得到UPGAM 聚类分支树状图,图形显示大鳍鱯群体聚集成两个类群,其中大的分支类群又分支成许多小的类群,这不仅表明了五强溪水库大鳍鳠种群的遗传多态性,也说明大鳍鱯种群存在明显的遗传分化。这一结果与周丽[2]关于长江水系4 个江段大鳍鳠群体存在遗传分化的研究结果一致。 本试验从水库的沅陵、泸溪、辰溪3 个不同江段分别随机采集10 尾大鳍鱯样本组成研究群体,聚类结果表明,3个江段的大鳍鱯个体并没有依不同江段而聚成3 个大的分支,而是沅陵江段的1 号个体与辰溪江段的27 号个体聚成一个大的分支,泸溪江段的全部10个个体与沅陵江段、 辰溪江段的另9 个个体聚成另一大的分支。 这说明水库大鳍鱯种群的遗传分化并不是因为采样江段的不同而导致。 3 个江段虽然在地理位置、生境和水文状态上存在差异,但仍是一个连续的水体,不同江段大鳍鱯个体之间必然会存在遗传基因交流。 而这种基因交流,可能既是水库大鳍鱯群体产生遗传多态性又出现遗传分化的重要原因。
图2 基于遗传距离构建的大鳍鱯30 尾个体的UPGMA 聚类图Figure 2 UPGMA clustering tree based on genetic distance of 30 individuals of M.macropterus
根据本文结果结合文献[2],推测在长江水系的不同水域中,大鳍鱯种群的遗传多态性与分化可能是一个普遍存在的现象。 本研究结果反映了沅水五强溪水库野生大鳍鳠群体的遗传多样性现状,这对于了解水电开发对鱼类遗传多样性影响及大鳍鳠资源的保护与利用具有较好的理论和实践指导意义。
C.S.Rubin 等[16]研究指出,物种数量一定程度的减少,并不一定影响其物种遗传多样性水平,然而严重的个体数量减少必定导致遗传漂变和近亲繁殖,这将造成物种遗传多样性水平的降低,最终成为许多物种致濒的原因。 大鳍鱯是长江流域一种特有的优质鱼类资源,近年来,由于过度捕捞、环境因素等原因,大鳍鳠鱼类资源量明显减少。 因此,尽管本研究结果表明沅水五强溪水库大鳍鳠遗传多样性丰富,但加强对这一特有优质鱼类资源的保护利用研究,有利于现有野生大鳍鳠种质资源量的恢复。