长链非编码RNA BC200在非小细胞肺癌患者组织中的表达及作用*

孟腾 徐美林 耿华 王菁 高国政

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占所有肿瘤的13%，从组织学上可分为（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。肺癌发病率和病死率近年来呈上升的趋势，肺癌患者5年生存率不足20%，晚期患者5年生存率更低，约2%［1-2］。各种调控基因在肺癌发生中起到重要作用，故探讨肺癌发生发展的机制具有重要意义。lncRNA 作为重要的调控因子，为恶性肿瘤的研究提供了新方向，lncRNA 是一类转录本长度超过200 nt功能性不编码蛋白的RNA分子，在肿瘤细胞的增殖、生长和凋亡的过程中扮演着不可或缺的角色，其表达异常与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等密切相关，可作为肿瘤临床诊断、疗效监测及预后评估的分子标志物［3-5］。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关，E-cadherin、N-cadherin 及Snail是上皮-间质转化相关蛋白，其中E-cadherin表达缺失是EMT最重要的标志［6］。研究表明，lncRNA BC200 在乳腺癌［7］、结肠癌［8］中明显升高，是一种与肿瘤细胞的增殖侵袭及转移密切相关的lncRNA［9］，且在结肠癌中证明与EMT有关。本研究通过检测BC200在NSCLC组织中表达水平，分析其临床意义，为寻找肺癌新的生物学标志物提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本资料 收集2014年1月至2018年7月天津市胸科医院经病理确诊的肺癌原发灶和配对癌旁肺组织标本（距癌边缘＞5 cm），共60 例，其中男性35例、女性25 例。TNM 分期：Ⅰ期27 例，Ⅱ～Ⅳ期33例；肿瘤大小：≤3 cm 39 例，＞3 cm 21 例；组织病理类型：腺癌37例，鳞癌23例；30例有淋巴结转移。所选患者术前均未行局部或全身放疗或化疗，均有完整的病理组织学和临床资料，至少由2位病理学专家进行诊断或复核。所有组织样本取下后立即液氮冷冻，随后转入-80℃冰箱保存。本研究获得天津市胸科医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂及仪器 Trizol 等提取RNA 所用试剂购自美国Invitrogen 公司；引物购于北京奥科鼎盛生物科技有限公司；RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒购于大连Takara 公司；VIIA7 DX 实时荧光定量PCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司；兔抗人Snail 抗体购于美国Abcam 公司（稀释浓度为1：100），兔抗人E-cadherin及鼠抗人N-cadherin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司（稀释浓度均为1：100）；二抗及DAB 显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和逆转录反应 取50 mg 的冻存组织磨成粉末状，加Trizol抽提RNA。组织中抽提RNA后，使用紫外分光光度计检测其纯度及浓度，取吸光度（A260/280）为1.8～2.0的RNA样本，将RNA样本按逆转录试剂盒说明书操作逆转录为cDNA，反应条件为30℃10 min，95℃5 min。

1.2.2 实时定量PCR 采用VIIA7 DX实时荧光定量PCR仪分析，按照SYBR Green说明书配制反应总体系20 μL：2×SYRR Green 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，RNase free ddH2O6 μL。反应条件如下：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，共40个循环。分析方法选用比较Ct值法（2-ΔΔCt法），Ct=ΔCt样本-ΔCt对照=［（样本Ct目的基因-样本Ct管家基因）-（对照组Ct目的基因-对照组Ct管家基因）］。

1.2.3 免疫组织化学染色法 组织标本经10%中性福尔马林缓冲液固定，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，连续切片，每张厚度4 μm。石蜡切片常规烤片，脱蜡，EDTA修复液修复，3%过氧化氢封闭10 min以阻断内源性过氧化物酶，滴加稀释的一抗，4℃冰箱过夜，二抗37℃水浴孵育20 min，DAB 显色，苏木素复染，封片。以PBS代替一抗为阴性对照。

1.2.4 结果判定标准 E-cadherin 和N-cadherin 均表达于细胞膜及近细胞膜处的少许细胞质，细胞质表达而包膜不表达者为阴性，Snail 表达于细胞质和细胞核，阳性细胞百分率及显色深浅采用半定量积分法分级。评分标准：随机选取10 个视野计数（×400），计数阳性细胞百分比。阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1 分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。阳性着色强度：无色为0分，黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞百分比和阳性着色强度乘积得分：＜3 分为阴性组，≥3分为阳性组。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料组间数据比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用pearson相关系数，诊断效能采用受试者工作特征（ROC）曲线来描述。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BC200与EMT相关蛋白在肺癌组织中的表达

实时荧光定量RT-PCR 检测结果显示，60 例NSCLC 患者中，BC200 在71.6%（43/60）的肺癌组织样本中表达高于癌旁正常组织，肺癌组织中BC200的表达水平显著高于癌旁组织中的表达水平（P＜0.01），N-cadherin 及Snail mRNA 的表达水平显著高于正常肺组织中的表达水平，E-cadherin mRNA 在癌组织的表达水平显著低于癌旁组织中的表达水平（P＜0.05）。

2.2 EMT相关蛋白的免疫组织化学法结果

E-cadherin 和N-cadherin 均表达于细胞膜及近细胞膜处的少许细胞质，Snail 表达于细胞质和细胞核（图1），免疫组织化学法结果显示，E-cadherin在癌组织中低表达或缺失表达，N-cadherin 及Snail 在癌组织中为高表达（P＜0.05），E-cadherin、N-cadherin及Snail 在NSCLC 组织中的阳性表达率分别为40%（16/40）、57.5%（23/40）、57.5%（23/40），在正常肺组织中的阳性表达率为95%（19/20）、5%（1/20）、10%（2/20），表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 免疫组织化学染色检测NSCLC 中E-cadherin、N-cadherin 和Snail的表达（SP法×200）

2.3 BC200表达水平与肺癌临床病理参数关系

BC200的表达与E-cadherin的表达呈负相关（r=-0.31，P＜0.05），与Snail、N-cadherin的表达呈正相关（r=0.305、r=0.257，P＜0.05）；NSCLC中临床分期Ⅱ～Ⅳ者、淋巴结转移者、E-cadherin阴性者、N-cadherin及Snail阳性者，BC200高表达者多，肺癌组织中BC200的表达水平与淋巴结转移、临床分期、E-cadherin、N-cadherin及Snail阳性率相关（P＜0.05），但与患者的年龄、性别、病理类型、肿瘤大小之间无明显相关性（表1，P＞0.05）。

表1 BC200表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

2.4 组织BC200水平在NSCLC诊断中的价值

组织BC200 水平诊断NSCLC 的价值较好，其曲线下面积分别为0.747（95%CI：0.660～0.835），灵敏度和特异度分别为60%和85%（图2）。

图2 BC200表达诊断非小细胞肺癌的ROC曲线

3 讨论

近年来，随着长链非编码RNA研究的深入，对肿瘤发生发展的机制研究已经从功能基因层面（编码蛋白质）逐渐拓展到非编码RNA。各种肿瘤包括NSCLC的发生发展的机制越来越多地在分子水平上被阐释，lncRNA作为重要的调控因子，已成为恶性肿瘤防治的研究热点，现已发现上千种lncRNA参与调控哺乳动物基因表达，在多种恶性肿瘤中均有lncRNA异常表达的报道，为临床诊断及靶向治疗等提供了理论基础［10-11］。通过高通量RNA测序（RNA-seq）对几种组织和细胞类型中的lncRNA表达已进行了定量分析［12］。有研究报道，前列腺癌的分子标志物前列腺癌抗原3（prostate cancer antigen 3，PCA3）［13］、肝癌的分子标志物（highly upregulated in liver cancer，HULC）［14］以及与多种恶性肿瘤有关的分子标示物肺腺癌转移相关转录本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）。lncRNA影响各种生物过程的潜在分子机制，包括染色质修饰、表观遗传调控、基因转录和翻译、RNA转换和基因组防御等［16］。

BC200 是一种在人类神经细胞中特异性表达的lncRNA，长度为200 nt，在神经细胞中由RNA 聚合酶Ⅲ转录，通过特定的调节机制调节神经元细胞突触小体的形成。BC200 通常仅在神经细胞和干细胞中表达，但有研究发现，BC200 在一些非神经系统的肿瘤组织中也呈现高表达（如肺癌、食管癌、乳腺等）［17］。Wu 等［8］发现，BC200 在结肠癌中表达上调，沉默BC200可能诱发明显G0/G1停滞，并通过抑制βcatenin 的表达而降低细胞周期蛋白D1，细胞周期素E 及c-Myc 的 表达，导 致HCT-116 和HT29 细胞 凋亡。下调BC200 会抑制HCT-116 和HT29 结肠癌细胞的增殖，并降低Ki-67 和PCNA 等细胞增殖标志物的表达以及MMP-2 和MMP-9 的表达，MMP-2 和MMP-9 的表达下降会减少HCT-116 和HT29 细胞的侵袭和EMT。本研究通过实时定量聚合酶链反应（QPCR）方法对60 例NSCLC 组织及癌旁配对肺组织的BC200的表达进行检测，并对其与临床病理特征的关系进行分析，发现NSCLC 患者癌组织中BC200 表达水平均显著高于配对癌旁组织（P＜0.01），与之前在结肠癌中的报道一致［8］。本研究发现，NSCLC 组织BC200 表达与某些病理特征有关，如TNM Ⅱ～Ⅳ期的BC200 水平高于Ⅰ期，提示NSCLC 的恶性程度可能与BC200 表达水平有关，BC200 水平越高NSCLC的恶性程度越高，可能与BC200 参与NSCLC 的恶性转化有关；组织BC200表达水平与淋巴结转移情况有关，淋巴结转移者的BC200 表达水平相对较高，提示BC200可能参与了NSCLC 的侵袭转移过程。EMT 与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关，E-cadherin对于维持细胞与细胞间的黏附能力非常重要，E-cadherin 的低表达与肿瘤侵袭、迁移密切相关。E-cadherin、N-cadherin及Snail是EMT相关蛋白，而E-cadherin 表达缺失是EMT 最重要的标志［6］。本研究对BC200 表达与E-cadherin、N-cadherin 及Snail 的表达相关性进行了初步的研究，免疫组织化学法检测到E-cadherin 在癌组织中低表达或无表达，N-cadherin及Snail在癌组织中为高表达（P＜0.05），E-cadherin阴性者、N-cadherin 及Snail 阳性者的NSCLC 中BC200高表达者居多，提示BC200在肺癌中的高表达可能与E-cadherin、N-cadherin及Snail均有关；QPCR法检测结果显示E-cadherin mRNA 在癌组织的表达水平显著低于癌旁组织中的表达，BC200、N-cadherin mRNA及Snail mRNA在癌组织的表达水平显著高于正常肺组织，BC200 的表达与E-cadherin 的表达呈负相关，与Snail、N-cadherin 的表达呈正相关，提示BC200 在肺癌中与EMT 有关，其可能通过EMT 调节肺癌细胞的侵袭和迁移。在NSCLC 诊断方面，组织BC200 水平有较高的价值，可考虑作为NSCLC 患者疾病诊断标志物在临床应用。