醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法改进研究

刘选梅 陈江

【摘 要】目的：为努力营造安全和谐与环保的生化实验室环境，针对学生在《醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白》实验中容易出现的诸多问题，结合多年的实验室实验教学经验，研究硼酸-硼酸鹽缓冲液替代巴比妥缓冲液的实验效果。方法：在使用DYY-6C电泳仪的基础上来对醋酸纤维薄膜开展电泳，进而分析在使用硼酸-硼酸盐缓冲液的情况下对醋酸纤维薄膜进行电泳而得到血清蛋白的分离图谱。结果：在相同实验条件下每张图谱都能显示出明显的5条区带，区带分离良好、轮廓清晰。结论：硼酸-硼酸盐缓冲液分离血清蛋白电泳实验中，实验结果更稳定且重复性好。

【关键词】硼酸盐缓冲液;醋酸纤维薄膜电泳;血清蛋白

中图分类号： Q503文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）08-0082-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.035

【Abstract】In order to create a safe，harmonious and environmentally friendly biochemical laboratory environment，aiming at many problems that often appear in the experiment of separation of serum protein by cellulose acetate membrane electrophoresis，the purpose of this paper is to create a safe，harmonious and environmentally friendly biochemical laboratory environment.The experiment effect of boric acid-borate buffer solution instead of barbitone buffer solution was studied based on the laboratory experiment teaching experience for many years.Methods on the basis of DYY-6C electrophoresis，the cellulose acetate film was electrophoresis，and then the separation map of serum protein was obtained by electrophoresis of cellulose acetate film with boric acid-borate buffer solution.Results under the same experimental conditions，each atlas can be obtained.There are 5 obvious zones with good separation and clear outline.Conclusion in the experiment of separation of serum protein with boric acid-borate buffer solution，the results are more stable and reproducible.

【Key words】Borate buffer solution;Cellulose acetate film electrophoresis;Serum protein

醋酸纤维薄膜电泳实际上属于区带电泳科技的范围，并以醋酸纤维薄膜充当支持物，将醋酸纤维薄膜充当支持物来开展蛋白电泳的优势在于简单、耗时短、容易辨别、不存在吸附等。在生物化学实验课里，《醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白》作为实验课的一个基础项目，之前本实验室醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验中一直用巴比妥缓冲液，但由于巴比妥属于镇静药物的范围，影响了其可得性，而且还有着一定的风险。本论文重点探究将巴比妥缓冲液用硼酸=硼酸盐缓冲液进行取代时的实验效果。从而探讨在开展《醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白》的实验项目里，巴比妥缓冲液被硼酸-硼酸盐缓冲液取代是否可行。

1 材料、仪器与试剂

材料、仪器

醋酸纤维薄膜（台州市路桥四生化塑料厂生产）、新鲜人血清北京六一DYY-6C型电泳仪，DYCP-31FA型电泳槽，722型分光光度计。

试剂

1）硼酸-硼酸盐缓冲液（0.08的离子强度、pH8.6）称取5.610g硼酸钠，5.60g硼酸，以及1.316g氯化钠，用蒸馏水溶解，并定容至1L。

2）染色液：氨基黑10B 0.5g，加入冰醋酸10mL，甲醇50mL，溶解并蒸馏水定容至100mL。

3）漂洗液：乙醇45mL，冰醋酸 5mL，蒸馏水50mL，适用于氨基黑10B染色的漂洗。要特别注意到需要使用密封瓶子来装漂洗液体和染色液体，要不然会出现部分成分挥发，导致溶液中不同成分的比例出现变化，进而对实验结论产生不良影响。

4）洗脱液：0.4mol/L氢氧化钠溶液，其能够洗脱氨基黑10B染色。

2 实验准备与操作步骤

2.1 浸泡和挑选醋酸纤维薄膜

首先辨别醋酸薄膜纤维的光面和毛面，然后在毛面距边1.5cm的地方使用铅笔轻画出痕迹，以当成点样标记。把醋酸纤维薄膜毛面的一面浸泡在放置硼酸盐缓冲区的容器中，让其在溶液中漂浮。如果在短时间达到湿润状态，而且薄膜展现出相一致的色泽，这意味着薄膜有着十分均衡的品质;如果达到湿润状态，薄膜上有着色泽不同的条纹等，这意味着这个薄膜在品质方面并不均衡。由于电泳的实验结果很大程度上都会受到醋酸纤维薄膜品质的影响，因此在开展实验之前挑选的薄膜务必要满足品质均衡。比如，如果薄膜的厚度不相同就会导致区带不平整，不同区带之间没有明确边界，很难再次取得同等实验结果等。使用镊子将挑选完成的薄膜压入到缓冲液里，使其全都被缓冲液浸透，隔夜浸泡。

2.2 制作搭桥

按照实验所需电泳槽的尺度，裁剪出33cm×12cm的纱布，然后将其折叠后放置于电泳槽的支架，将纱布一边和支架邊缘重合，另一边浸到缓冲液中。直到纱布都被缓冲液浸湿以后，使纱布紧贴在支架上 ， 即为搭桥。搭桥完成，将电泳槽里添加硼酸-硼酸盐缓冲液至水平线，最终让两边缓冲液的液面完全相等，要不然在经过薄膜的过程中会出现虹吸状况，最终对蛋白质分子的电泳时间造成影响。

2.3 点样器的制作

把质地均匀的盖玻片通过玻璃刀剪切成宽度为1㎝的点样器，并打磨其边缘，将其清洁备用。

2.4 点样

取出完全浸透的薄膜，放置在干净的滤纸中央，并去除过多的缓冲液进而防止出现样品扩散的现象，然而也不能吸取太多，要不然会导致样品难以通过薄膜网孔，进而导致电泳起点各式各样，不尽相同，最后对分离结果产生不良影响;之后在点样支持物上安置薄膜毛面，点样器吸取合适分量的血清，将其垂直印在薄膜毛面距边界1.5㎝的地方，详细信息由图1所示。点样过程中要保证平稳的力度，防止区带内有斑点发生。

2.5 电泳

把点样完成的薄膜将点样面向下贴于阴极电泳槽的滤桥，点样区带和电泳槽之间距离大约保持在10mm，必须让其保持距离;把另一侧贴于阳极电泳槽的支架，两侧务必要和滤桥密切贴合，务必不要气泡出现，而且中间确保不出现下垂现象。薄膜间要有超过2mm的间距，只有保持距离才能够让血清位于原本的薄膜之上;而且薄膜和滤纸桥之间要保持垂直，薄膜和电流的趋势保持一致，要不然会产生电泳区带地点出现偏移。将电泳槽的盖盖上，让薄膜在10分钟内保持平衡。达到平衡就能够开展电泳。在电泳过程中，电泳仪需设置电压120V，0.4到0.6mA/cm的电流，电泳耗时为一个小时，取得预期结论。电泳区带平整，界限明显，区带分离清晰。要十分注意，由于电泳槽、薄膜数量和电泳仪之间的差异，实验室提供的电流条件和电压条件也有着差异，所以要根据实际情况进行测算。而且在通电过程中千万不要直接触摸薄膜或者缓冲液，避免出现触电状况。

2.6 染色

完成电泳，立刻关闭电源，将薄膜拿出后放进染色液里，进行10分钟的染色。在染色环节要经常微晃染色器皿，达到理想的染色效果。当有着很多数量的薄膜条，要防止出现因为相连而没有均匀染色的状况。

2.7 漂洗

在实验环节里，通过反复漂洗的手段，然而以节约为主，将之前的6次漂洗更改为3次，也就是用3个器皿装着漂洗液，所有漂洗液的容量都是500ml，然后从染色液里取出薄膜，尽可能地去除染色液，通过镊子夹住薄膜在培养皿里进行3次不间断的摆动，一直持续到背景被漂洗干净。

2.8 拍照

将薄膜放置于清洁滤纸之间，将过多的水分吸掉，经过风干再对其拍照。

2.9 定量

挑选在同等实验环节中，有着比较理想的醋酸纤维素薄膜，然后剪掉蛋白质的不同色带以及一条空白带，将其对应放置在六个不同试管里，使用氢氧化钠溶液（0.4mol/L）对其进行洗脱，三十分钟以后在722型分光光度计的基础上于620nm波长的环境下开展色泽对比，最终计算不同实验组中所含有蛋白的百分比。

3 实验结果与分析

在本实验室开展试验的过程中，使用0.4-0.6mA/cm的电流，120V电压，电泳耗时为45分钟到60分钟。电泳的区带整齐、分明，区带之间分离彻底。本次实验过程中还认真探索和完善了点样环节、染色环节等，而且取得了预期的实验目标。

硼酸-硼酸盐缓冲液能替代巴比妥缓冲液，《醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白》在实验进行环节，必须要严格按照上述环节开展，能够达到95%的实验成功率。在优化以后有着比较良好的实验重复效果。所以，在实验教学里，使用优化之后的实验步骤在一定程度上能够增强教学质量。

从图3能够看出实验电泳图谱，图中从下到上的区带是，γ-球蛋白区带、β-球蛋白区带、α2-球蛋白区带、α1-球蛋白区带以及血清清蛋白区带，能够看出区带分离取得很好的效果，有着清楚的边界，明显的显示出5条区带。

4 结论

电压与电泳时间是影响电泳结果的两个重要因素，在同等的实验条件中，硼酸-硼酸盐缓冲液分离的人血清蛋白电泳图谱十分清楚，通过电泳得到的图谱，其结论十分平稳有着较高的重复度，而且生产花费较少，在学生进行生物化学实验的过程中这种方法比较适用。

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