柠檬酸发酵废渣中氨基葡萄糖盐酸盐提取工艺优化

朱晓萍 颜毛毛 权海峰 檀利军 张慎 李慧

【摘 要】本研究以柠檬酸发酵废渣为原料，选提取温度、盐酸浓度、提取时间、料液比为考察因素，以提取率作为考察指标，进行单因素试验，再利用正交试验法研究制备氨基葡萄糖盐酸盐工艺的最佳提取条件。研究表明：25%盐酸，废渣与盐酸料液比1：2，85℃下酸解4h，此条件下，氨基葡萄糖盐酸盐粗品得率为2.14%，说明该提取工艺实际可行，对柠檬酸废渣中氨基葡萄糖盐酸盐的回收利用具有重要意义。

【关键词】柠檬酸发酵废渣;氨基葡萄糖盐酸盐;酸解;正交试验

中图分类号： TQ460.6文献标识码： A文章编号： 2095-2457（2019）08-0017-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.006

【Abstract】In this study， Fermentation residue from citric acid was used as raw material. The investigation factors was chosen as temperature， concentration of hydrochloric acid， time and ratio of material to liquid; The single factor experiment was conducted with the extraction rate as the evaluation index. The optimum extraction conditions for the preparation of glucosamine hydrochloride were studied by orthogonal test. The results showed that 25% hydrochloric acid， the ratio of waste residue to hydrochloric acid was 1：2， and the yield of crude glucosamine hydrochloride was 2.14% under this condition. It shows that the extraction process is practical and feasible， and it is of great significance for the recovery and utilization of glucosamine hydrochloride from citric acid waste residue.

【Key words】Citric acid fermentation residue; Glucosamine hydrochloride; Acidolysis; Orthogonal test

氨基葡萄糖，又称氨糖，其常以N-乙酰基衍生物的形式存在于微生物，动物中。氨糖的化合物常以盐酸盐、硫酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖的形式存在[1]。氨基葡萄糖盐酸盐（Glucosamine Hydrochloride，GAH）是甲壳素的一种衍生物，浓盐酸环境中，甲壳素可水解生成GAH，后经中和、脱盐、脱色等步骤得到白色结晶。GAH作为化工合成原料，具有促进抗生素药注射的功能， 也可供糖尿病人作营养助剂，此外还可用于化妆品、饲料添加剂和食品添加剂[2];GAH性质稳定，具有抗炎、抗氧化、防腐、抗菌、抗腫瘤等多种作用，同时也是合成有关药物的重要原料，已经在医药、生物技术、纺织、食品、化妆品和饲料添加剂等领域得到了广泛的应用[3-4]。

柠檬酸是一种重要的有机酸，也是世界上厂里较大的有机酸产品之一，目前发酵法生产柠檬酸时常使用黑曲霉。我国是柠檬酸生产大国，从发酵生产柠檬酸工厂废渣——黑曲霉菌丝体中提取GAH，不仅可降低成本，且为综合利用发酵废渣提供一条新途径[5-6]。

本实验通过酸解提取的方式从柠檬酸废渣中获取氨基葡萄糖盐酸盐，从而充分利用废渣，从废渣中提取一些活性物质，改善了污染。为了发挥更大的用处，提取出更多有用的物质，研究温度，时间，盐酸浓度，料液比四种因素的影响，根据单因素试验，结合正交设计软件，得到优化后的提取条件，增加收率，更好地减少浪费和污染[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

主要原料：柠檬酸废渣（黑曲霉菌丝体）来自安徽丰原集团柠檬酸车间。

标准品：D-氨基葡萄糖盐酸盐对照品，纯度99.18%。

试剂：浓盐酸，乙醇，磷酸三钠-四硼酸钠，乙酰丙酮溶液PDABA（对-二甲胺基苯甲醛）溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料预处理

用自来水清洗至清洗液pH为7，将柠檬酸废渣与水的混合物在5000rpm下离心10min进行固液分离，40℃下干燥，干燥至水分低于10%。

1.2.2 氨基葡萄糖盐酸盐提取工艺

称取200g处理后的废渣（黑曲霉菌丝体），放入提取装置中，按照一定料液比加入适当的盐酸，于温度下反应一段时间，待反应液降至室温后对反应液进行抽滤，除去残渣（可将滤渣进行二次提取），将提取液置于旋转蒸发仪上在60℃下对滤液进行减压浓缩，再对浓缩液进行降温结晶，将所析出的晶体溶解于适量水中，加入一定量的活性炭（5g/L），在60℃下于磁力搅拌器上搅拌1h脱色，脱色完成后对溶液进行抽滤，随后用旋转蒸发仪对溶液进行浓缩，向浓缩后的溶液中加入95%乙醇使氨基葡萄糖盐酸盐析出结晶，离心、洗涤、干燥后得成品。

1.2.3 氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线制备

精密称取105℃干燥至恒重的D-氨基葡萄糖盐酸盐50.0mg，用水定容至100mL配制成0.50mg/mL，再用水稀释成50.00ug/mL的标准溶液。

分别吸取标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL于25mL具塞比色管中，加蒸馏水至5.00mL。加乙酰丙酮溶液1.0mL具塞混匀，沸水浴30min后冷却。再加无水乙醇3.0mL、PDABA溶液1.0mL。摇匀，60℃水浴1h，立即冷却。以空白为对照，用分光光度计在520nm处测定吸收值，制得标准曲线。

1.2.4 氨基葡萄糖盐酸盐的含量测定[8]

1.3 单因素实验设计

1.3.1 反应温度对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

以料液比为1：3，25%盐酸，反应时间3h，反应温度分别为75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，考察反应温度对氨基葡萄糖盐酸盐得率的影响。

1.3.2 盐酸浓度对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

以料液比为1：3，反应温度为85℃，反应时间3h，分别添加浓度为10%、15%、20%、25%、30%的盐酸溶液，考察盐酸浓度对氨基葡萄糖盐酸盐得率的影响。

1.3.3 提取时间对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

以料液比为1：3添加25%盐酸溶液，反应温度为85℃，反应时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，考察反应时间对氨基葡萄糖盐酸盐得率的得率的影响。

1.3.4 料液比对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

设置反应温度为85℃，反应时间3h，加入不同体积的25%浓度盐酸溶液，使料液比分别为1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3，考察不同料液比对氨基葡萄糖盐酸盐得率的得率的影响。

1.4 正交设计优化氨基葡萄糖盐酸盐制备工艺

在单因素实验的基础上，影响因素有：酸解温度，酸解时间，料液比，盐酸浓度。选取合适的因素水平，使用正交设计助手3.0进行正交试验设计，对实验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

根据标准曲线制备方法，统计数据得到氨基葡萄糖盐酸盐的标准曲线，标准曲线的方程为y=0.0112x-0.0029，R2=0.9999。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酸解温度对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

称取200g处理过的柠檬酸废渣，按照3：1的比例加入浓度为25%的盐酸，分别于75℃、80℃、85℃、90℃、95℃下酸解3h，对照图2可知：85℃下的提取收率最高。

反應温度对酸解、氧化及其他副反应的影响比较大。从实验结果看，粗品收率随着提取温度从75℃到85℃提升时，显著上升，在85时达到最高，达2.32%。当温度继续上升时，粗品收率明显下降。同时还出现粗品颜色变深的情况，推测由于温度过高，酸解出的产物遭到破坏而导致[9]。经过多批次实验证明，当酸解温度在90℃以上时，成品脱色较为困难。

2.2.2 盐酸浓度对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

称取200g处理过的柠檬酸废渣，按照3：1的比例分别加入浓度为10%、15%、20%、25%、30%的盐酸，在85℃条件下反应4h，对照图3可知：盐酸浓度为25%时的提取率最高。

盐酸浓度的影响：盐酸浓度对柠檬酸废渣的酸解结果影响很大。当盐酸浓度过高时，副反应增多，炭化现象较为严重，颜色发黑，同时，随着时间反应的延长，料液粘稠度增加，搅拌困难，造成成品收率和质量的下降。在盐酸浓度低于20%时，氨基葡萄糖盐酸盐粗品收率较低，随着盐酸浓度的增加，当盐酸浓度为25%时，得到的粗品最为纯净。

2.2.3 提取时间对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

称取200g处理过的柠檬酸废渣，按照3：1的比例加入25%的盐酸，在85℃条件下，分别进行酸解反应2h、3h、4h、5h、6h，对照图2-4可知：酸解4h时的粗品收率最高。

酸解时间的影响：从实验结果来看，在其余条件相同的情况下，酸解反应时间为4h是，粗品收率最高，达2.42%。当反应时间过长时，氨基葡萄糖盐酸盐将在继续酸解的过程中发生复合与再分解反应而遭到破坏;而酸解反应时间过短时，酸解反应不彻底，造成粗品收率偏低[10]。

2.2.4 料液比对氨基葡萄糖盐酸盐提取率的影响

称取200g处理过的柠檬酸废渣，用25%的盐酸分别按照1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3的比例，根据粗品收率得出最高收率为2.55%，对照图3-4可知：最适的料液比为1：2。

从实验结果来看，酸解反应需要在一定的盐酸量下进行，盐酸的用量太少的话，酸解不彻底，所以收率相应也比较低，当盐酸体积与原料比达到2：1时，收率最高，达到2.55%，但当盐酸体积与原料比超过2时，收率未见显著变化，可见过量盐酸对收率影响不大。从成本方面考虑，增加盐酸的用量，成本就会随之提高，但收率并不增加。增加盐酸的比例，有利于反应的进行，因为盐酸是作为催化剂成分在反应过程中的;作为催化剂的盐酸，不代表量越高，对反应的效果就越好，用量过高，给后面的处理带来相应的困难;但是盐酸得量又过少，则三角烧瓶内的体系粘稠度会增加，不能够充分反应，且容易造成粘壁，增加副反应，降低收率[11]。综上，用25%的盐酸，料液比为2：1时产率最高，条件最适。

2.3 正交实验结果及分析

由表1可知：料液比>提取温度>提取时间>盐酸浓度，最适提取条件为A2B3C2D2，即盐酸浓度为25%、料液比为1：2（g/mL）、提取温度为85℃、提取时间为4h，在该条件下进行平行试验，实验结果如下表所示。

在正交试验中得到的最佳提取条件即A2B3C2D2，在表格中为出现该组结果，因此，设计验证实验，进行三组平行试验，结果见表2，在最优工艺下进行提取，最终所得粗品得率为2.14±0.06%。

3 讨论

本文研究从柠檬酸发酵废渣中提取氨基葡萄糖盐酸盐，并精致成高纯度成品的工艺过程。该项工艺创造性的对原料进行了水洗烘干处理，根据实验可以得出相对比较合理的酸解工艺，在精制过程中结合了纳滤膜的使用，制得了纯度较高的氨基葡萄糖盐酸盐。最为理想的工艺过程为：先用自来水清洗柠檬酸废渣，使清洗液PH=7时，将柠檬酸废渣与水的混合物在5000rmp下离心10min进行固液分离，在烘箱中以40℃进行干燥至水分低于10%。配置成25%的盐酸溶液。称取200g经水洗烘干后的柠檬酸废渣，浸泡入配置好的盐酸溶液，在85℃条件下酸解4h。过滤除去滤渣保留滤液，在旋转蒸发仪中进行浓缩，浓缩后放入冰箱中冷却结晶，得到GAH粗品;粗品再经溶解脱色，纳滤再浓缩除杂，醇析后得到GAH成品。

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