膜分离纯化桔梗总黄酮及其体外抗氧化性检测

孙晓春，黄文静，李 铂，任 飞，唐志书

(陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712083)

桔梗(Platycodongrandiflorum)为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属植物桔梗的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排脓之功效[1]。桔梗中主要含有皂苷、黄酮、多糖等有效成分[2]。研究表明黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[3,4]。王晓林等[5]采用单因素试验及正交实验方法研究了桔梗茎总黄酮的纯化工艺和体外抗氧化性。膜分离方法主要是依据不同分子量进行分离，从而达到纯化浓缩的目的[6]。本研究采用膜分离方法对桔梗总黄酮进行纯化，并对纯化所得桔梗总黄酮进行体外抗氧化性检测，以期为膜分离方法的应用奠定基础，为天然抗氧化剂的开发提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

桔梗(批号20141001，陕西兴盛德药业有限责任公司)，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为桔梗科植物(Platycodon grandiflorum)的干燥根。

乙醇(成都科龙试剂)，DPPH (笛医生物科技有限公司)，总抗氧化能力试剂盒 (批号20180306，南京建成生物工程研究所)。

KQ3200超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，FA2004B电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)，LNG-CM-101膜分离设备(上海朗极膜分离设备工程有限公司)，UV-2600紫外分光光度计(日本岛津)，1510全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)。

1.2 桔梗总黄酮的制备

称取桔梗粉末150 g，加入料液比为1：20的80%乙醇超声提取30 min ，过滤、浓缩、冷冻干燥得桔梗总黄酮粗提物，以F表示。将桔梗总黄酮粗提物加入适量蒸馏水，配置成质量浓度为8 mg·mL-1溶液，取1L 溶液用膜分离设备进行分离。第一种方法：依次过0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔径的膜，收集滤液；第二种方法：过0.8 μm孔径的膜，收集滤液。第三种方法：过0.2 μm孔径的膜，收集滤液；第四种方法：过0.05 μm的膜，收集滤液。将滤液浓缩、冷冻干燥成粉末，分别以F1、F2、F3、F4表示，称重。

1.3 桔梗总黄酮含量检测

总黄酮含量的测定采用 NaNO2-A1(NO3)3法[7]。总黄酮含量(%)=桔梗总黄酮质量/桔梗总黄酮粉末质量×100。

1.4 体外抗氧化性检测

清除DPPH·活性测定方法，参照吴小燕等[8]的清除DPPH·活性测定方法。清除·OH活性测定方法，参照汪荔等[9]的清除·OH活性测定方法。总抗氧化能力测定按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计分析

试验所得数据利用Excel 2013进行分析和制图。

2 结果与分析

2.1 桔梗总黄酮含量检测结果

桔梗总黄酮含量检测结果如表1所示，桔梗总黄酮粗提物F中总黄酮含量为50.10%，依次过0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔径的膜分离后得到的桔梗总黄酮F1中总黄酮含量为52.35%，F1粉末质量为3.0015g，这可能是因为经过3种孔径的膜微滤后损失较大。F2、F3和F4中桔梗总黄酮含量分别为61.14%、66.58%和60.25%，F3中桔梗总黄酮含量最大，表明经过0.2 μm孔径膜微滤后除杂效果较好。

表1 桔梗总黄酮含量检测结果

2.2 体外抗氧化性检测结果

2.2.1 清除·OH活性测定结果 桔梗总黄酮清除·OH活性测定结果如图1所示，桔梗总黄酮F3对·OH清除能力最高，，浓度为1.0 mg·mL-1时，清除率为68.42%，浓度为2.0 mg·mL-1时，清除率达到79.16%；其次是F2和F4，浓度为2.0 mg·mL-1时，对·OH清除率分别为73.01%和74.87%；F1和F对·OH清除能力较低，浓度为2.0 mg·mL-1时，对·OH清除率分别为66.03%和62.52%。图1结果与表1中桔梗总黄酮含量检测结果相一致，F3中桔梗总黄酮含量最高，对·OH清除能力亦最高。

图1 桔梗总黄酮对·OH清除结果

2.2.2 清除DPPH·活性测定结果 桔梗总黄酮清除DPPH·活性测定结果如图2所示，随着桔梗总黄酮浓度的增加，对DPPH·的清除能力随之增加，呈量效关系。对DPPH·的清除能力结果为F3>F2>F4>F>F1，与表1结果基本一致，即总黄酮含量越高，对DPPH·的清除能力越强。F3浓度为1.0 mg·mL-1时，对DPPH·清除率为90.50%.

图2 桔梗总黄酮对DPPH·清除结果

2.2.3 总抗氧化能力测定结果 总抗氧化能力以达到同样A值所需的FeSO4的浓度(mmol·L-1)表示，所需FeSO4的量越大，表明总抗氧化能力越高。结果如图3所示，表明F3总抗氧化能力最高，其次为F2，而F、F1和F4三种桔梗总黄酮的总抗氧化能力无明显差异。

图3 桔梗总黄酮总抗氧化能力检测结果

3 结论

桔梗总黄酮粗提物经不同孔径膜纯化后，得到4种桔梗总黄酮。结果表明，经0.2 μm孔径膜微滤除杂效果较好，F3中桔梗总黄酮含量最高为66.58%，对·OH、DPPH·的清除作用以及总抗氧化能力均最高。F3浓度为1.0 mg·mL-1时，对·OH和 DPPH·的清除率分别为68.42%和90.50%。