绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

胡业辉，李益鹏，王紫英，陈 勖，任 真，丁 澦

(复旦大学 生命科学学院 生理学与生物物理学系，上海 200438)

绿色荧光蛋白(GFP)作为一种标记分子，已经被广泛应用于基因表达的检测、靶蛋白在细胞或生物体内的定位等研究[1-6].理论上通过GFP抗体可针对融合GFP的蛋白质复合物进行操纵[7-8]，但由于GFP抗体分子较大，很难穿透细胞膜或克隆后进行传代表达，且其与GFP结合位点多样，限制了这一技术的应用.1999年，Reiter等构建了一组具有高度特异性和生物活性的重链可变区蛋白[9]，与传统抗体不同的是，这种抗体由骆驼VHH链的单链抗原结合结构域开发，仅由两条重链组成，通常直径为2.5nm、高度约4nm、分子量在12～15kDa，因此也被称为纳米抗体[10-11].纳米抗体自身性质稳定，易于在各种表达系统中表达，在各种细胞中都能很好地折叠[12-14]，并且由于其体积较小，与抗原结合后空间位阻较小[15-16].2010年，Leonhardt等通过噬菌体库筛选构建出了针对GFP的纳米抗体文库GBP系列(GFP binding protein)[17]，但这些GBP与GFP及其衍生荧光蛋白的亲和力等性质有待进一步揭示.

我们首先大量表达、纯化出重组GBP1蛋白，每升菌液可得到43mg纯度超过95%的重组GBP1蛋白.通过分子筛层析、MST[18]和BS3交联实验，检测了GBP1与sfGFP(绿色)，EGFP(绿色)，T-Sapphire(绿色，紫外激发)，CyPet(青色)，YPet(黄色)，ZsGreen(绿色，来源于Zoanthus)和mDsRed(红色)等7种荧光蛋白的结合能力.研究结果表明，GBP1仅能特异性地结合源自Aequoreavictoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白，其中GBP1与EGFP(Kd=0.85nmol/L)的亲和力最强.

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌菌株E.coliDH5a、BL21(DE3)购自Novagen公司；KOD Plus聚合酶和DNA连接试剂盒购自Toyobo公司；核苷酸、琼脂糖凝胶、DNA提取试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Roche Diagnostics公司；引物合成和DNA序列分析由Invitrogen公司完成；限制性核酸内切酶购自TaKaRa公司；Ni-NTA介质购自Qiagen公司；Mono Q阴离子交换层析柱和分子筛层析柱Superdex75 Increase购自GE公司；BS3交联试剂和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司；MST试剂均购自Nano Temper公司；所有其他药物都为分析纯试剂.

1.2 构建原核表达载体

由PDB ID： 3K1K获得GBP1的编码序列[17]，对其进行密码子优化，优化后的基因序列由Genewiz公司合成.将GBP1基因插入到pT7N10C6载体中，其N端带有His-tag10标签，交由测序公司对质粒进行检测.

1.3 GBP1蛋白与荧光蛋白的表达与纯化

构建好的表达载体转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)菌株，挑取单克隆菌落，接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜.按照Studier的方法制备自动诱导培养基[19]，将0.5mL细菌悬浮液转移至500mL含有同样浓度氨苄青霉素的自动诱导培养基中，37℃振荡培养至OD600值为0.6后，将菌液转移至20℃，继续培养20h.最后，6000×g、20min离心收集菌体，-80℃保存.

首先通过Ni-NTA亲和层析对GBP1蛋白进行纯化.将冻存菌液充分重悬于A-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH 8.0]，150mmol/L NaCl，10%(体积比)甘油，20mmol/L咪唑)中，冰上超声裂解细菌，裂解液于4℃、20000×g、20min离心两次，取上清.上清液低速流过A-Buffer预平衡的Ni-NTA层析柱，B-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，10%(体积比)甘油，500mmol/L咪唑)将GBP1蛋白洗脱.

5倍体积的QA-Buffer(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，10%(体积比)甘油)稀释Ni-NTA洗脱液，稀释液流过QA-Buffer预平衡的阴离子交换层析柱，QA-Buffer再次平衡后，0～0.9mol/L NaCl高盐缓冲液线性梯度洗脱GBP1蛋白.4℃透析除去洗脱液中过多的盐，透析缓冲液为： 50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，0.5mmol/L EDTA，10%(体积比)甘油.通过SDS-PAGE和BandScan 4.30(Glyko)对纯化后蛋白的纯度和浓度进行分析.最后用储存缓冲液(50mmol/L Tris-HCl[pH8.0]，150mmol/L NaCl，0.5mmol/L DTA，80%(体积比)甘油)将GBP1蛋白更换至含有40%甘油的缓冲液中，终浓度约2mg/mL，并储存在-80℃.

荧光蛋白的克隆、表达和纯化与GBP1蛋白类似，我们共表达纯化了EGFP，sfGFP，CyPet，T-Sapphire，YPet，ZsGreen和mDsRed等7种荧光蛋白，且重组荧光蛋白纯度均大于95%.

1.4 MALDI-TOF/TOF质谱检测

分子筛层析将纯化后的GBP1蛋白换液至5mmol/L NH4Ac缓冲液中，取一管洗脱液用于Bruker FLEX MALDI-TOF仪器的线性模式MALDI-TOF检测.相关参数： 加速电压为27kV，平均进行100～150次扫描，分子量参照标准品为BSA蛋白(M+66431)(Sigma，St.Louis，MO，USA).

1.5 分子筛层析

分子筛层析缓冲液(GF-Buffer)为： 50mmol/L HEPES[pH7.4]、150mmol/L NaCl，GBP1与各荧光蛋白分别按照1∶1、1∶2和2∶1的摩尔比例混合后上样，上样量0.5mL，流速0.5mL/min.UV 280监测蛋白总吸收峰，特定激发波长监测荧光蛋白的特征吸收，根据洗脱峰的迁移判断GBP1蛋白与荧光蛋白的结合.

1.6 微量热泳动

将GBP1蛋白用MST-Buffer(含有0.1% Tween-80的GF-Buffer，以降低蛋白样品的吸附)稀释至7000nmol/L 或1400nmol/L.GBP1与CyPet，T-Sapphire，ZsGreen和mDsRed的结合能力较弱或不结合，因此在这些测试中GBP1的浓度为7000nmol/L，其他测试中GBP1的浓度为1400nmol/L.将荧光蛋白用GF-Buffer稀释至10～500nmol/L.MST缓冲液将GBP1蛋白连续稀释12～14个梯度，每个梯度10μL；加入等体积的荧光蛋白稀释液，吹打混匀；室温孵育5～10min后，将各梯度样品转移至Monolith NTTM毛细管中，Monolith NT.115仪器进行检测.检测数据通过Nanotemper分析软件(1.5.41)进行分析，利用Thermoporesis+T Jump数据拟合结合曲线.

1.7 BS3交联实验

将GBP1蛋白和荧光蛋白更换到交联缓冲液(20mmol/L PBS[pH7.5]，150mmol/L NaCl)中.分3组将GBP1蛋白和荧光蛋白预混： 第1组GBP1和荧光蛋白浓度均为0.02mmol/L；在第2组中，GBP1的浓度是0.04mmol/L，荧光蛋白是0.02mmol/L；在第3组中GBP1的浓度是0.02mmol/L，荧光蛋白是0.04mmol/L.BS3交联剂溶于100% DMSO后加入到混合的蛋白样品中，终浓度为3mmol/L，室温孵育30min；加入终止缓冲液(1mol/L Tris-HCl[pH7.5])，孵育15min；样品95℃煮沸，3min，12% SDS-PAGE鉴定.

1.8 等温滴定量热

将待测蛋白用GF-Buffer透析平衡过夜至缓冲液一致.将GBP1蛋白稀释至125μmol/L，将荧光蛋白稀释至12.5μmol/L，在MicroCal iTC200等温滴定量热仪用GBP1蛋白滴定荧光蛋白.两次滴定的间隔时间为150s，共滴定19次，首次滴定体积为0.4μL，2～19次滴定体积为2.0μL，反应温度为25℃，样品池反应体积为0.204mL.等温滴定量热(ITC)实验的结果由ITC Analyse软件分析处理.

2 结果

2.1 GBP1蛋白的表达、纯化及鉴定

为了提高GBP1蛋白的表达量，我们首先根据对密码子进行优化，然后选择含有T7启动子的pET衍生载体pT7His作为其表达载体.通过自动诱导系统大量表达GBP1蛋白，经Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析两步纯化，每升大肠杆菌培养液可得到43mg纯度大于95%的重组GBP1蛋白(表1).如图1(a)所示，纯化后的GBP1蛋白主带在15.5kD附近，大于理论分子量13.9kD，为此我们通过MALDI-TOF线性模式质谱测定了样品分子量，分析结果显示(图1(b))，GBP1蛋白的分子量为13.9kD，与理论计算分子量一致，SDS-PAGE迁移偏慢是由于GBP1蛋白自身迁移速度较慢所导致.分子筛层析检测结果表明(图1(c))GBP1蛋白的洗脱位置在13.45mL处，生理状态下为单体.

表1 1L大肠杆菌培养液中GBP1蛋白的产量产率分析

图1 GBP1蛋白的表达与纯化Fig.1 Analysis of the expression and purification of GBP1(a) SDS-PAGE检验GBP1蛋白的表达与纯化： 1. 自动诱导后全菌裂解液，2. 离心后全菌上清液，3. Ni-NTA流出液，4. Ni-NTA高盐清洗液，5. Ni-NTA洗脱得到的GBP1蛋白，6. 阴离子交换层析纯化后GBP1蛋白，M为蛋白标准品；(b) MALDI-TOF/TOF质谱验证纯化的GBP1的分子量；(c) 分子筛层析检验GBP1蛋白的聚合状态.

2.2 分子筛层析检验GBP1与荧光蛋白的结合

分子筛层析能够利用自身凝胶孔径的大小将不同分子量的蛋白样品进行分离，分子量越大越早被洗脱.实验中用到的Superdex75 10/100层析柱的分离范围为4～70kD，涵盖了GBP1与荧光蛋白的分子量.荧光蛋白分子量是GBP1蛋白两倍左右，GBP1在14mL被洗脱，荧光蛋白约11mL被洗脱(图2).若二者存在稳定的结合，GBP1-FP复合物会早于荧光蛋白被洗脱出来，根据洗脱位置即可判断二者间是否存在结合.如图2(a～c)所示，GBP1与sfGFP、YPet和CyPet以摩尔比1∶1混合样品，会在11mL被洗脱，早于荧光蛋白的洗脱峰，故重组GBP1蛋白与sfGFP、YPet和CyPet之间存在较强的相互作用.而mDsRed-GBP1蛋白样品没有提前洗脱(图2(d))，洗脱位置与mDsRed一致，故与mDsRed无结合.

图2 分子筛层析检测GBP1蛋白与几种荧光蛋白的结合能力Fig.2 Verify the binding of GBP1 to fluorescent proteins by size exclusive chromatography(a) GBP1与sfGFP(绿色)的结合；(b) GBP1与YFP(橘色)的结合；(c) GBP1与CFP(青色)的结合；(d) GBP1与RFP(红色)的结合；蓝线为GBP1，黑线为GBP1-FP复合物.

2.3 微量热泳动检测GBP1与荧光蛋白的结合能力

微量热泳动仪通过检测温度梯度中荧光分子的迁移，实现对其结合能力的定量分析.我们的研究中，荧光蛋白自身带有荧光，无需标记，可直接检测.表2及图3总结了重组GBP1蛋白与不同荧光蛋白的解离常数，与GBP1结合能力最强的是EGFP，解离常数为0.85nmol/L.

图3 微量热泳动检测GBP1蛋白与几种荧光蛋白的结合能力Fig.3 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by microscale thermophoresis(a)～(g)为GBP1与荧光蛋白EGFP、sfGFP、YPet、T-Sapphire、CyPet、ZsGreen和mDsRed的结合曲线.

GBP1与Aequoreavictoria来源的荧光蛋白均结合，其亲和力从高到低依次为： EGFP(0.85nmol/L)>sfGFP(2.29nmol/L)>YPet(3.60nmol/L)>T-Sapphire(139nmol/L)>CyPet(3610nmol/L)，其中GBP1与绿色荧光蛋白(EGFP和sfGFP)的结合亲和力高，与黄色荧光蛋白(YPet)亲和力稍弱，与青色或紫外激发荧光蛋白(T-Sapphire和CyPet)亲和力较低；GBP1与红色荧光蛋白mDsRed及其他来源的绿色荧光蛋白ZsGreen(海葵Zoanthus来源)之间没有结合.

2.4 BS3交联实验

我们通过BS3交联实验进一步检测了GBP1与荧光蛋白的相互作用.根据GBP1与荧光蛋白浓度比的不同，将交联实验分为3组，具体的浓度见材料与方法部分.实验结果(图4)表明，提高mDsRed的浓度，GBP1与mDsRed之间依然没有发生交联；GBP1与sfGFP、YPet之间存在着明显的交联现象；GBP1与CyPet之间的交联现象相对较弱，与MST的结果一致.

图4 交联实验验证GBP1与不同荧光蛋白的结合能力差异Fig.4 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by crosslinking experiment1～4、5～8、9～12的GBP1∶FP(摩尔比)分别为1∶1、2∶1、1∶2；G为sfGFP、Y为YPet、C为CyPet、R为mDsRed.

2.5 等温滴定量热实验

我们通过等温滴定量热(ITC)实验进一步验证了GBP1与荧光蛋白之间相互作用的参数，结果如图5所示.除mDsRed及ZsGreen不与GBP1结合外，Aequoreavictoria来源的CyPet与GBP1的亲和力也较低，无法拟合出结合曲线.ITC实验得到的GBP1与荧光蛋白之间的亲和力强弱顺序与MST结果一致，但所测得的结合常数有些差距，可能是因为ITC测试时，蛋白浓度过高导致聚集，从而使ITC结果不够准确，但若降低待测蛋白质浓度，则会导致热量变化过小而无法获得良好信噪比的数据.

图5 等温滴定量热实验检测GBP1与不同荧光蛋白相互作用的结合能力和动力学参数Fig.5 Verify the binding of GBP1 to different fluorescent proteins by isothermal titration calorimetry(a) GBP1 to EGFP： n=1.47±0.29,K=(1.77±1.02)×105L/mol,ΔH=-(10.65±0.16)cal/mol,ΔS=24.0cal/(mol·deg); (b) GBP1 to sfGFP： n=1.03±0.02,K=(3.53±2.26)×104L/mol,ΔH=-(8.14±0.23)cal/mol,ΔS=20.8cal/(mol·deg); (c) GBP1 to T-Sapphire： n=1.24±0.27,K=(2.24±1.53)×105L/mol,ΔH=-(10.47±0.16)cal/mol,ΔS=24.4cal/(mol·deg); (d) GBP1 to YPet： n=1.25±0.02,K=(4.69±3.38)×104L/mol,ΔH=-(5.89±0.18)cal/mol,ΔS=21.3cal/(mol·deg).

3 讨 论

本项研究通过优化密码子、选用高表达原核载体、优化表达条件等方法，大量纯化得到重组GBP1蛋白，建立了简单高效且易重复的针对荧光蛋白纳米抗体的技术流程.同时，我们测定了GBP1和7种不同荧光蛋白之间相互作用的强度.以上研究为将来进一步开展通过纳米抗体操纵荧光蛋白的研究提供了基础数据，明确了相关应用针对不同荧光蛋白的适用范围和合适浓度.我们正在尝试将GBP1交联到层析介质，利用GBP1与GFP的特异性结合，对已建立的可视化GFP细胞或动物模型进行操纵，通过GBP1获取与GFP融合的靶标蛋白质复合物进行纯化与鉴定，从而加深对相关靶标蛋白的功能理解.另外，GBP1可与一系列工具酶进行融合表达，利用GBP1与GFP的特异性相互作用，可在实时观测GFP的基础上，在体内实时通过这些工具酶对GFP融合的靶蛋白进行操纵.