超声-乙醇法提取铁皮石斛花总黄酮及其体外抗氧化性的研究

缪园欣，廖明星，孙爱红，丁文文*

（1.荆楚理工学院 生物工程学院，湖北 荆门 448000；2.湖北省荆门市畜牧兽医局，湖北 荆门 448000；3.荆楚理工学院 医学院，湖北 荆门 448000）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）具有“益胃生津、厚肠胃”的功效，在《神农本草经》中被誉为“滋阴圣品”[1]。对铁皮石斛化学成分研究发现其含有多糖[2]、氨基酸[3]、芪类[4-5]、生物碱[6]、黄酮[7]等成分。对铁皮石斛药理活性研究，发现其具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗辐射、调节免疫等功效[8-10]。铁皮石斛主要以茎作为药用部位，而其他部位未被药用，造成了极大的浪费[1]。对铁皮石斛花的成分和功能进行研究，发现其具有和茎相似的成分和功效[11-12]。黄酮类物质广泛存在于植物中[13]，对高血脂、高胆固醇等慢性疾病具有治疗和预防作用，此外还具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等活性[14-15]。目前，对铁皮石斛黄酮的研究主要集中在茎和叶中的黄酮，而对石斛花中黄酮报道较少[16-17]。

植物黄酮提取方法有加热提取法、有机溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取[18]等。其中超声提取法具有溶剂用量少、提取速度快、提取效率高等特点[19-20]。因此本实验采用超声-乙醇法对铁皮石斛花总黄酮提取工艺进行优化，并对铁皮石斛花总黄酮的体外抗氧化性进行研究，为开发利用铁皮石斛花提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛花：湖北洲和生态农业发展有限公司；芦丁标准品（色谱纯）：南京杜莱生物科技有限公司；水杨酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；亚硝酸钠、硫酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：武汉中南化工试剂有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）（分析纯）：Sigma公司；试验用水为离子交换水。

1.2 仪器与设备

DZF真空干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；TY-1901型分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；YJ1002型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；TG16-WS型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-100KDB型高功率数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

取铁皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用万能粉碎机粉碎，经40目筛子得石斛花粉末备用。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

称取20 mg于105℃干燥至质量恒定的芦丁标准品，置于100 mL容量瓶中，加60%乙醇完全溶解定容，得质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液。分别吸取芦丁标准液0、1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL、6.0 mL、7.5 mL、9.0 mL、10.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%Na2NO21 mL，摇匀，静置7 min。加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，摇匀静置7 min。加入1 mol/L NaOH溶液10 mL，摇匀静置12 min后用体积分数为60%乙醇定容至刻度，静置10 min，于波长510 nm处测吸光度值。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 铁皮石斛花总黄酮的测定

精密称取铁皮石斛花粉1 g，按不同的料液比加入不同体积分数乙醇，在100 W超声功率下超声辅助提取一定时间。提取完成后浓缩至20 mL，再用60%乙醇定容至50 mL得总黄酮提取液，按1.3.2的方法操作测得总黄酮浓度，并依据下列公式计算得出总黄酮提取率：

式中：C为石斛花样品中总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为样品溶液稀释液体积，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.4 铁皮石斛花总黄酮提取工艺优化试验

（1）料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 g样品，分别按1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g∶mL）的料液比加入体积分数70%的乙醇，室温浸泡18 h，于40℃条件下100 W超声处理40 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度值，并计算石斛花总黄酮得率。

（2）乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 g样品，按1∶35（g∶mL）的料液比分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，室温浸泡18 h，于40℃条件下100 W超声处理40 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度值，并计算石斛花总黄酮得率。

（3）超声时间对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000g样品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室温浸泡18h，于40℃条件下100W超声处理10min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度值，并计算石斛花总黄酮得率。

（4）超声温度对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 g样品，按1∶35（g∶mL）的料液比加入80%的乙醇，室温浸泡18 h，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃条件下100W超声处理40min。提取结束后浓缩、定容，测定吸光度值，并计算石斛花总黄酮得率。

1.3.5 提取工艺优化正交试验设计

为了确定最佳提取条件，在单因素试验的基础上，以石斛花总黄酮提取率为评价指标，设计L9（34）正交试验，对料水比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度4个因素在3个不同水平上进行优化试验，因素与水平见表1。

表1 总黄酮提取工艺条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 铁皮石斛花黄酮体外抗氧化活性测定

（1）DPPH自由基清除能力测定

取0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL、10.0 mg/mL的铁皮石斛花总黄酮溶液各3 mL于试管中，分别加入1.0 mL 0.1 mmol DPPH无水乙醇溶液，充分混匀后避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度值为Ai，VC作阳性对照；对照组以无水乙醇代替DPPH，测定吸光度值Aj；空白组以蒸馏水代替总黄酮溶液，测定吸光度值为A0[21]。

（2）羟基自由基清除能力测定

取0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL的石斛花总黄酮溶液各3mL，加入1.0 mL 6 mmol/L硫酸亚铁、1.0 mL 10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，加入1 mL 6 mmol/mL过氧化氢，置于37℃反应10 min，于波长510 nm处测吸光度值Ai。以VC作为阳性对照，蒸馏水代替水杨酸测吸光度值Aj，空白对照以2.0 mL蒸馏水代替石斛花总黄酮溶液测定吸光度值A0[22]。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线及回归方程

以芦丁标准液质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

根据图1，求得回归方程A=8.7361C-0.0024，相关系数R2为0.999 4，表明在该浓度范围内芦丁浓度与吸光度线性关系良好。

2.2 铁皮石斛花总黄酮提取单因素试验结果与分析

2.2.1 料液比对铁皮石斛花总黄酮提取率的影响

图2 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由图2可知，料液比在1∶20～1∶35范围内，随着体积分数70%乙醇溶液使用量的增加，细胞壁内外浓度差增加，细胞内有效成分易渗出，石斛花总黄酮提取率增加；此后，继续增加溶剂用量，由于空化泡吸收的超声波能量减少，细胞壁破裂不完全不利于提取溶出[20]，总黄酮提取率呈下降趋势。因此，铁皮石斛花总黄酮提取时的最佳料液比为1∶35（g∶mL）。

2.2.2 乙醇体积分数对铁皮石斛花总黄酮提取率的影响

由图3可知，乙醇体积分数在40%～80%范围内，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率呈增加趋势；当乙醇体积分数超过80%时，由于醇溶性杂质溶出量增加，总黄酮提取率降低。因此，乙醇体积分数选择80%较为适宜。

图3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超声时间对总黄酮提取率的影响

图4 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

由图4可知，超声时间在10～40 min范围内，铁皮石斛花总黄酮提取率随超声时间的延长而增加；当超声时间超过40 min时，由于长时间的热效应和机械效应破坏了部分黄酮结构，黄酮提取率下降[23]。因此，铁皮石斛花总黄酮提取的最佳超声时间为40 min。

2.2.4 超声温度对总黄酮提取率的影响

图5 超声温度对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of total flavonoids

由图5可知，超声温度在30～40℃范围内，随着超声温度的升高，乙醇容易向石斛花粉内部渗透，利于有效成分浸出，铁皮石斛花总黄酮提取率逐渐增加；此后，继续升高温度，部分黄酮在高温作用下结构受损[24]，总黄酮提取率下降。因此，选择温度40℃为最佳超声温度。

2.3 提取工艺优化正交试验

为确定最佳提取条件，在单因素试验的基础上，研究乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间对铁皮石斛花总黄酮提取的影响，以石斛花总黄酮提取率为评价指标，进行L9（34）正交试验。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通过表3中提取率的极差分析结果可知，影响提取率的各因素主次顺序为乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间＞料液比。从k值得出使石斛花总黄酮提取最佳的工艺条件为A2B2C2D3，即乙醇体积分数80%，料液比1∶35（g∶mL），超声温度40℃，超声时间50min，在此条件下石斛花总黄酮提取率最高，为2.31%。由表3方差分析结果可知，因素A、C对石斛花总黄酮提取率有极显著影响（P＜0.01），因素B、D对石斛花总黄酮提取率有显著影响（P＜0.05），对总黄酮提取率影响的主次顺序为A＞C＞D＞B，即乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间＞料液比，与直观分析结果一致。

2.4 铁皮石斛花总黄酮体外抗氧化活性测定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的测定

图6 石斛花总黄酮对DPPH·清除率曲线Fig.6 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on DPPH·

由图6可知，石斛花总黄酮对DPPH自由基的清除率呈现浓度依赖性，随着总黄酮浓度的增加，清除率增加；质量浓度在0～2 mg/mL范围内，石斛花黄酮的DPPH自由基的清除率显著低于VC，VC质量浓度为0.5 mg/mL时DPPH自由基的清除率就达到90.35%，而此时石斛花黄酮的DPPH自由基的清除率仅为39.37%，继续增加VC含量其DPPH自由基的清除率无显著变化，而石斛花黄酮的DPPH自由基的清除率呈浓度依赖性变化，质量浓度达2 mg/mL时，石斛花黄酮的清除率达到82.98%。质量浓度在2～10 mg/mL范围内，VC的DPPH自由基的清除率依旧无显著变化，石斛花黄酮的DPPH自由基的清除率缓慢趋近VC的清除率，当质量浓度为10 mg/mL时石斛花黄酮的DPPH自由基的清除率达89.77%。

2.4.2 清除羟自由基能力的测定

图7 石斛花总黄酮对·OH清除率曲线Fig.7 Scavenging curves of total flavonoids from Dendrobium officinaleflowers on·OH

由图7可知，石斛花总黄酮对羟自由基的清除率具有浓度依赖性，清除率随浓度的增加而增加，质量浓度在0～10 mg/mL范围内，石斛花黄酮的羟自由基清除率显著低于VC，VC质量浓度为0.5mg/mL时羟自由基清除率为90.26%，而此时石斛花黄酮的羟自由基清除率仅为11.29%，进一步的提高质量浓度，VC的羟自由基清除率无显著变化，石斛花黄酮的羟自由基清除率呈浓度依赖性变化，当质量浓度为10 mg/mL时石斛花黄酮的羟自由基清除率达80.01%。

3 结论

本研究探讨了铁皮石斛花总黄酮的提取工艺，结果表明，各因素影响铁皮石斛花总黄酮提取率的主次顺序为：乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间＞料液比。通过单因素试验及正交试验确定超声波乙醇法提取铁皮石斛花总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%，料液比1∶35（g∶mL），超声温度40℃，超声时间50 min，在此条件下铁皮石斛花多糖提取率为2.31%。对超声波乙醇法提取的铁皮石斛花总黄酮进行DPPH自由基清除率和羟自由基清除率测定，发现质量浓度在0～10 mg/mL范围内铁皮石斛花总黄酮的自由基清除率具有浓度依赖性，当质量浓度达10 mg/mL时，其清除率分别为89.77%和80.01%，因此石斛花黄酮有较好的抗氧化活性。这为铁皮石斛花的深入研究及开发利用提供了一定的理论参考。