北京生菜黑斑病病原菌鉴定

卢 蝶，李佳霖，陈笑瑜，韩莹琰，尚巧霞*

(1.农业应用新技术北京市重点实验室，植物生产国家级实验教学示范中心，北京农学院，北京 102206；2.北京市植物保护站，北京 100029)

生菜LactucasativaL.种类繁多，根据叶片的形状不同分为皱叶生菜、散叶生菜和结球生菜[1-2]，由于生菜生产周期短，口感脆嫩并且营养价值较高，现已成为北京市播种面积最大的绿叶蔬菜[3-4]。随着人们对生菜需求量的扩大，种植面积逐年增加，在种植过程中容易发生病害[5]。生菜黑斑病分布较广，种植地区都可发生，严重时发病率可达60%以上，在一定程度上影响生菜质量导致减产[6]。目前报道的生菜黑斑病病原菌种类较多，有微疣匐柄霉Stemphyliumchisha.、芸薹链格孢Alternariabrassicae，苦苣菜链格孢A.sonchi，细链格A.tenuis、互隔链格孢A.alternata等[7-9]。现对北京地区发生的生菜黑斑病进行了调查，对其病原菌进行分离鉴定，旨在明确引起生菜黑斑病的病原菌的确切种类，研究结果对进一步研究该病害有重要意义，并可为生菜病害的研究和防治工作提供必要的依据。

1 材料与方法

1.1 病害样品采集及处理

2017年4月于北京市昌平区生菜种植温室采集具有典型生菜黑斑病症状的叶片，记录病害典型症状、采集时间、地点等，4 ℃保存，用于分离培养。

1.2 病原菌分离培养与纯化

采用组织分离培养法，从采集的病害叶片病健组织交界处，切取 5 mm×5 mm植物组织，经75%乙醇处理1 min进行表面消毒，无菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干组织表面水分，置于PDA培养基中央培养(25 ℃)。长出菌落后，采用逐级稀释法进行单孢分离，置于PDA上培养7 d后，4 ℃保存[1]。

1.3 病原菌形态学鉴定

观察病原菌菌落的颜色、形状等形态特征，并利用光学显微镜观察菌丝和孢子形态特征，记录孢子形状、大小等[10]。

1.4 病原菌的致病性测定

采用刺伤接种方法对纯化病原菌进行致病性测定[11]。选取大小一致的健康叶片，用70%酒精对其表面进行消毒 1 min，用打孔器取纯化的病原菌，刺伤接种到健康生菜叶片上，以刺伤不接种为空白对照，25 ℃保湿培养7 d。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

取适量病原菌纯培养菌丝，采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司)提取DNA，以ITS1和ITS4为引物进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环； 72 ℃延伸10 min。反应结束后PCR产物经0.1%琼脂糖凝胶电泳检测，取10 μL的PCR扩增产物由北京博迈德基因技术有限公司测序，将所测病原菌的序列于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的 BLAST上进行同源性比对[12]。

2 结果与分析

2.1 田间症状表现

生菜黑斑病主要为害叶片，在叶片上形成褐色斑点，圆形至近圆形，有同心轮纹。病斑大小差异较大，一般为 3～15 mm。空气潮湿时病斑易穿孔，病斑表面不产生霉状物(图1)。

图1 生菜黑斑病叶片症状Fig.1 Symptom of lettuce black spot on leaf

2.2 病原菌形态学鉴定

纯化培养的病原菌菌落为圆形，初期灰色，后转为灰黄色至暗灰褐色，菌落生长较快，中间颜色较深(图2)。通过光学显微镜观察，病原菌为链格孢菌(Alternariasp.)，分生孢子暗褐色，倒棍棒形或椭圆形，有横膈膜1～4个，纵膈膜0～3个，柄色淡，直立或弯曲(图3)。

图2 生菜黑斑病病原菌的菌落图Fig.2 Colony of the pathogen of lettuce black spot

图3 生菜黑斑病病原菌的分生孢子Fig.3 Spores of the pathogen of lettuce black spot

2.3 病原菌的致病性测定

刺伤接种7 d以后发现，初期叶片出现褐色小斑点，随后逐渐扩大成褐色典型病斑，在10 d后生菜叶片上的褐色病斑，逐渐扩大至叶片大部分坏死(图4)。从发病叶片上分离的病原菌与接种病原菌相同。

图4 致病性测定的初期和后期症状Fig.4 Initial and late symptom in pathogenicity test

2.4 病原菌分子生物学鉴定

利用引物ITS1和ITS4扩增病原菌DNA后得到的ITS序列片段大小在500～750 bp(图5)。

DNA Marker AL 2000; CK. 空白对照; 1-4.病原菌DNA图5 生菜黑斑病病原菌DNA的ITS扩增产物M. DNA Marker AL 2000; CK. blank control; 1-4. DNA ofthe pathogenFig.5 ITS amplification products of DNA from the pathogen causing lettuce black spot

病原菌DNA的ITS扩增产物大小为549 bp，所测序列于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上进行同源性比对，与Gene Bank中的Alternariaalternata的序列同源性达到100%。

3 结论与讨论

通过对生菜黑斑病病原菌分离物的形态学观察、致病性测定和 ITS序列分析发现，生菜黑斑病叶片感病，形成圆形至近圆形褐色斑点，褐色至灰褐色，有同心轮纹，空气潮湿时病斑易穿孔；通过致病性测定，接种病原菌后的生菜叶片产生的症状与田间生菜发病症状一致，从发病叶片上分离的病原菌与接种病原菌相同；测序结果进行BLAST同源性比对，与Alternariaalternata序列的同源性为100%。生菜黑斑病的病原菌经鉴定为半知菌类丝孢目链格孢属互隔链格孢Alternariaalternata。

生菜(莴苣)黑斑病的病原菌种类较多，常见的为S.chisha、A.brassicae、A.sonchi、A.tenuis、A.alternata等[7-9]。但近年来S.chisha引起的生菜(莴苣)病害被称为莴苣匍柄霉叶斑病[13-14]。目前关于生菜黑斑病的病原菌研究较少，具体是由哪些菌侵染引起，是1种还是几种共同致病尚无定论。研究结果确定了北京地区发生的生菜黑斑病的病原为A.alternata，但是北京地区生菜黑斑病是否还可以由其他种类的链格孢菌Alternariasp.侵染致病，还需进一步研究。

Alternariasp.具有寄主范围广，传播途径多和侵染力强等特点，可引起多种经济作物上的病害，曾经在各国都造成过巨大的经济损失。目前已报道的由A.alternata引起的植物病害有多种，其中马铃薯早疫病于1982年在美国佛蒙特州首次报道，造成了严重的经济损失[15]。除了马铃薯早疫病之外，A.alternata还可以引起棉花轮纹病、烟草赤星病、千金子早疫病等，以上病害的发生危及到农作物、药材等生产，造成了巨大经济损失[16-18]。因此要及早对该类病害进行预防诊断，筛选新的高效低度药剂进行防治，避免出现更大的经济损失。