IL-2、IL-21 诱导人外周血单个核细胞及其抗肿瘤作用

吴育罗 涂海旋 官哲

随着生物技术不断发展, 特别是细胞技术的进步, 使肿瘤过继性细胞免疫治疗成为手术、化疗、放疗后恶性肿瘤的第四种治疗手段［1］。既往的研究与临床实践显示, 肿瘤过继性细胞免疫治疗应该是一种比较理想、疗效良好的肿瘤治疗手段, 然而目前在临床应用上的疗效并不能让医师及患者满意, 仍存在细胞活性差、抗瘤谱局限的缺点［2-4］。利用细胞因子之间的免疫调节网络机制, 协同增强彼此的生物学功能,有望进一步提高肿瘤过继性细胞免疫治疗的临床疗效。本研究探讨了IL-2、IL-21 诱导人外周血单个核细胞及其抗肿瘤作用, 现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 在2017年9月~2018年2月抽取正常健康人的外周血, 并应用Ficoll密度梯度法分离PBMC, 制作成细胞悬液(1×106/ml), 并分为对照组、IL-2 组、IL-21 组和联合组。对照组加入0.1 ml生理盐水, IL-2组加入100 IU /ml的IL-2, IL-21组加入100 IU/ml的IL-21, 联合组加入IL-2、IL-21各50 IU/ml。四组均放置在37℃并在含有5% CO2的孵箱中培养, 共培养4 d。

1.2 方法

1.2.1 PBMC活细胞计数 在培养第4天后收获PBMC, 在倒置显微镜下观察, 并计算活细胞, 连续3次, 取平均值。

1.2.2 PBMC表型测定 应用PBS洗涤各组PBMC, 分别加入PE-CD56与FITC-CD3, 在4℃环境下避光染色30 min, 并连续使用PBS洗涤2次, 然后使用流式细胞仪检测四组的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平。

1.2.3 肿瘤细胞杀伤率测定 使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定, 取培养4 d的PBMC作为效应细胞(E), 以对数生长期的4种肿瘤细胞作为靶细胞(T), 稀释靶细胞5×103/孔,效靶比例(E∶T)为20∶1, 然后计算肿瘤细胞杀伤率。

1.3 观察指标 比较四组的活细胞计数、CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平以及肿瘤细胞杀伤率。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组活细胞计数比较 联合组、IL-2组、IL-21组、对照组的活细胞计数分别为(0.02±0.01)、(0.31±0.05)、(0.42±0.06)、(0.69±0.08), 联合组、IL-2组、IL-21组活细胞计数均明显高于对照组, 联合组的活细胞计数明显高于IL-2组、IL-21组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 四组CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平比较 联合组、IL-2组、IL-21组的CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平均高于对照组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 四组CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

表1 四组CD3-/CD56+、CD3+/CD56+水平

注：与对照组比较, aP＜0.05

组别 CD3-/CD56+ CD3+/CD56+IL-2组 20.61±3.98a 3.08±1.68a IL-21组 18.23±3.99a 3.02±1.61a联合组 25.77±4.89a 5.72±1.98a对照组 10.11±3.01 1.02±0.60

2.3 四组肿瘤细胞杀伤率比较 联合组对人胃癌细胞系M85、胃癌细胞系BGC823、结肠癌细胞系HCT116、结直肠腺癌细胞系HCT8的杀伤率分别为41.0%、40.0%、19.0%、16.0%, 均明显高于IL-2组、IL-21组及对照组, 且IL-2组、IL-21组的肿瘤细胞杀伤率均明显高于对照组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 四组肿瘤细胞杀伤率比较(%)

3 讨论

IL-21 是IL-2 细胞因子家族的新成员, 主要是由活化CD4+T 细胞分泌出来的, 在B 细胞、T 细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)以及单核来源的树突状细胞(DC 细胞)上都能够发现其受体。IL-21 是一种多效因子, 但是对人体免疫细胞活化的影响目前还未可知, 因此在探讨IL-21 对于PBMC 的诱导作用以及对肿瘤的杀伤性是非常有必要的。

大量研究显示, 多种细胞因子的联合应用是能够减低单一细胞因子用量, 多种细胞因子与淋巴细胞之间通过存在的网络调节机制诱导培养细胞, 可以提高肿瘤过继性免疫治疗的疗效［5,6］。经研究发现, IL-2、IL-21 都能够增强人体NK 和细胞毒性T 淋巴细胞(CTL 细胞)功能［7］。有研究显示, 黑素瘤小鼠在应用过继性T 细胞移植之后, DC 细胞上的黑素瘤接受疫苗后在应用IL-2、IL-21 联合治疗, 相较于IL-2、IL-21 单独使用治疗, 联合治疗的疗效比较显著, T 细胞的应答比较好, 抗肿瘤的活性比较持久［8］。IL-2、IL-21联合使用能够将NK 细胞分化成一种成熟的细胞, 以促进穿孔素的表达, 从而让NK 细胞出现脱粒或增强细胞溶解性的能力。本研究发现, IL-2、IL-21 联合使用对NK 和CTL 细胞是能够产生诱导激活作用的。IL-21 能够在影响NK 细胞的同时, 通过NK 细胞内的胞膜分子形成胞内分子的表达从而调节NK 细胞的活性。人体试验与小鼠试验结果是不一样的, IL-2、IL-21 必须联合使用才能够有效地维持人体的NK细胞存活, 并能够有效上调各种分子的表达。

从表2 可以看出, IL-2、IL-21 联合使用不仅可以激活NK 和CTL 细胞, 还可以发挥特异性的抗肿瘤效应, 对于人体胃癌细胞的杀伤力明显比结肠癌细胞以及结直肠癌细胞的杀伤力更强。可以推测, 这种抗肿瘤的类型以及功能上的差异和肿瘤细胞表达分子是有一定关联的。免疫系统对于肿瘤的杀伤力是建立在免疫能够识别的基础上, 因此在肿瘤免疫中, 细胞的免疫学特性是非常重要的。但是因为肿瘤免疫学特性的多样性, 因此必须根据肿瘤细胞免疫学特征制定相应的治疗方案, 才能够有效地提高免疫治疗的抗肿瘤作用。

综上所述, IL-2、IL-21 联合使用能够诱导人的PBMC,且抗肿瘤作用比较显著, 值得在临床推广。