CAR-NK细胞在癌症免疫治疗中的研究进展

梁皓，肖向茜，盛望

北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124

2017年是嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫疗法的突破元年，先后有2 款CAR-T 细胞疗法经美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，用于急性淋巴细胞白血病和复发性或难治性大B 细胞淋巴瘤[1-2]。虽然CAR-T 细胞有良好的应用前景，但同时存在许多不足之处。自然杀伤（natural killer，NK）细胞作为另一种重要的肿瘤杀伤性免疫细胞，在CAR的应用中具有T 细胞没有的一些优势：异体NK 细胞不会引起移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD），并已在许多临床试验中得到证实[3-4]；NK 细胞不分泌引起细胞因子释放综合征的炎症因子，如IL-1、IL-6等[5]；CAR-NK 细胞除了CAR 介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK 细胞自身抗肿瘤的特性，识别并杀伤CAR 靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果[6]；NK 细胞来源丰富，包括外周血（peripheral blood，PB）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPCS）、NK-92 等细胞系[7-9]，使其能成为一种“现货（off the shelf）”细胞产品。在此，我们简要综述近年来CARNK 细胞在免疫治疗中的进展。

1 NK细胞简介

NK 细胞占外周血淋巴细胞的10%～15%[10]，根据CD16 与CD56的表达情况可分为CD56brightCD16-和CD56dimCD16+等 2 种 NK 细胞[11]，它们在表型、组织分布和免疫效果上各不相同。CD56dim细胞在外周血中占NK 细胞总量的90%，它们是完全成熟的NK 细胞，在免疫杀伤中占主导地位。由于CD56dim细胞表达Fcγ受体CD16，它可以发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[12]。与之相比，CD56bright细胞未完全成熟，它们主要负责细胞因子的分泌，具有较弱的细胞毒性。CD56bright细胞在外周血中含量较少，在二级淋巴器官中含量较高，说明可能具有更好的渗透性，易于穿过血管到达组织中[13]。

2 NK细胞的来源

用于临床治疗的NK 细胞有多种来源，尽管自体NK 细胞可应用于细胞过继治疗中，但它在临床中治疗肿瘤的效果有限[14]，所以CAR 应用于异体来源的NK 细胞中会更有前景。异体NK 细胞的来源包括外周血、NK 细胞系、脐带血、诱导多能干细胞等（表1）。

2.1 外周血

NK 细胞可以从人的外周血中通过血浆分离置换法分离出来[15]，由于其在外周血中所占比例较低，通常需要在体外扩增以达到临床使用的数量。通过添加IL-2 和饲养细胞（提前辐照过的转染EB 病毒的淋巴细胞系），NK 细胞得到大量扩增[16]。另一种方法是用转染4-1BB 配体和mbIL-15的HLA 缺陷型K562 细胞作为饲养细胞在体外扩增NK 细胞[17]。饲养细胞的存在可能会增加NK 细胞在临床中的副作用[18]，所以无饲养细胞的扩增技术相继发展。Wagner 等利用两步法技术，在IL-15 和IL-21的帮助下得到大量具有杀伤活性的NK 细胞[19]。

目前已有多项关于外周血来源的CAR-NK 细胞用于癌症免疫治疗的研究，其中靶向CD19 最为突出，修饰后的CAR-NK 细胞在急性B 淋巴细胞白血病的治疗中具有十分理想的疗效[29-30]。对于实体瘤的治疗，研究人员开发了多种靶向肿瘤相关抗原的 CAR-NK 细胞，如靶向 GD2、EGFR 和PSCA 等[29-31]。经过 CAR 修饰后的 NK 细胞对表达相应抗原的靶细胞展现出更强的细胞毒作用。其中，最为特别的是以NKG2D 作为胞外域的CAR结构[32]，NKG2D 可以与多种肿瘤表面的配体结合，有广谱抗癌效果，NKG2D-DAP10-CD3ζ构建的CAR-NK 细胞对于骨肉瘤、前列腺癌、横纹肌瘤等肿瘤有着良好的杀伤效果。

2.2 NK细胞系

与外周血来源的NK 细胞相比，NK 细胞系具有许多优势，便捷的扩增方式和均一的表型使其最有希望成为“现货”细胞产品。目前已建立了多种NK细胞系，如NK-92、YTS、KHYG-1 等，其中对NK-92细胞的研究最为广泛。NK-92 细胞是1992年从一位非霍奇金淋巴瘤病人体内分离得到的[39]，表型为CD56brightCD16-NKG2A+KIR-（除 KIR2DL4）[40-41]。临床试验证明NK-92 细胞具有良好的生物安全性，即使病人注射了1010/m2的NK-92 细胞，仍未观察到明显的副作用[42-44]。NK-92 细胞是目前惟一被FDA 批准用于临床治疗的NK 细胞系，但临床疗效有限，所以导入CAR 提高NK-92 细胞的治疗效果十分必要。近几年，不同研究组用NK-92 细胞表达多种CAR 用于白血病与实体瘤的研究[33-38]，如靶向CD19的细胞用于治疗淋巴瘤和白血病，靶向CS-1的细胞用于治疗多发性骨髓瘤，靶向EGFR的细胞用于治疗神经母细胞瘤，靶向EpCAM的细胞用于治疗乳腺癌，靶向GPC3的细胞用于治疗肝细胞癌等。尽管NK-92 细胞吸引了很多研究者的目光，其自身也存在诸多缺点。由于NK-92 细胞来源于非霍奇金淋巴瘤病人，为了安全性考虑，在临床应用中NK-92 细胞须提前接受辐射照射，因此大大降低了其在体内的持续性与有效性[45]。同时，NK-92 细胞激活与增殖需要依赖IL-2，在临床应用中系统性的IL-2 给药有很严重的副作用，并且会激活免疫抑制信号[46]。此外，NK-92 细胞表面缺乏多种激活性受体，如NKp44和NKp46，且不表达CD16，无法引起ADCC[47]。

2.3 脐带血

脐带血来源的NK 细胞复苏后即可使用，无须考虑如NK 细胞系所存在的安全性隐患，使它同样拥有成为一种“现货”细胞产品的潜力。脐带血中的NK 细胞比列（15%～20%）与NK 细胞在外周血中的比例类似[48]，由于一份脐带血的容量较少，使得从中获得足够数量的NK 细胞用于临床治疗成为一项难题。静息状态的脐带血NK 细胞表现为未成熟状态，其表面高表达抑制性受体NKG2A 并低表达激活性受体如 NKp46、NKG2C 和DNAM-1 等[49]。为了克服这些缺陷，Shah 等使用细胞膜表面表达IL-21 和4-1BB 配体的GMP 级K562 细胞作为人工提呈细胞，使一份脐带血可以产生足够临床免疫治疗的NK 细胞用量[50]。通过体外激活，脐带血NK 细胞最终可以表达出完整的激活性受体与抑制性受体，达到与外周血中NK 细胞相似的细胞毒性[51-52]。

2.4 诱导多能干细胞

iPSC 衍生出的NK 细胞同时拥有外周血NK细胞和NK 细胞系的优点，它不仅性质均一可以大量扩增，而且无须辐照即可注入体内。iPSC 可以轻易地从皮肤或外周血中获取，一旦转化后便可在体外无限扩增[53]。目前的证据表明，对于卵巢癌细胞系 MA148 和 A1847，iPSC-NK 细胞比外周血NK 细胞展现了更强的细胞毒作用[54]。CAR-iPSC-NK 已在动物实验中被证实可行，并显示出很好的肿瘤清除效果[38]。

3 CAR-NK细胞在临床治疗中的应用

目前已有14 项关于CAR-NK的临床试验，其中中国 5 项、美国 3 项、新加坡 1 项、德国 1 项，Allife 医药科学技术有限公司资助的4 项临床试验处于早期Ⅰ期，未提供相关的详细资料，无法统计（未列出）。这些临床试验多集中于血液肿瘤研究，占9 项，剩余6 项尝试解决CAR-T 未能解决的实体瘤。圣犹德儿童研究医院完成了第一个关于CAR-NK的临床Ⅰ期试验（NCT00995137），这项研究使用靶向CD19的CAR-NK 细胞治疗B 系急性淋巴细胞白血病。NK细胞来源于供者外周血，表达IL-15 和4-1BB 膜结合配体的K562 细胞系经辐照后作为饲养细胞扩增PB-NK细胞。随后在NK细胞中导入CAR结构（Anti-CD19+4-1BB+CD3ζ），再将其注射到病人体内，目前相关试验结果尚未公开。在另一项使用PB-NK的研究中（NCT03415100），广谱性 CAR-NK（靶向NKG2D 配体）首次应用于临床，用于治疗多种转移性实体瘤。使用NK-92 细胞系与脐带血来源NK 细胞的临床试验也在同步展开。博生吉医药科技（苏州）有限公司是中国最早使用NK-92 细胞进行CARNK 研究的机构，目前有4 项分别靶向CD19、CD7、CD33 和MUC1的临床试验正在开展。MD 安德森癌症中心开展2 项脐带血来源的CAR-NK 细胞用于治疗B 细胞淋巴瘤。2 项试验的区别在于是否伴随高剂量化疗与骨髓移植，使用的CAR 结构是相同的。他们不仅导入了包含Anti-CD19+CD28+CD3ζ的CAR结构，还导入了作为自杀基因的iCasp9 与增强NK细胞活性的IL-15 基因。CAR-NK 细胞临床试验汇总见表2。

表2 CAR-NK细胞临床试验

4 CAR-NK细胞存在的挑战

尽管CAR-NK 细胞具有许多优势，但在目前的临床应用中仍存在着一些挑战。首先的障碍是转染方式的选择。目前的转染方式主要分为病毒载体和非病毒载体。对于病毒载体而言，逆转录病毒的转染效率很高[55]，但这种方法会引发随机插入突变的发生，有一定概率的致瘤性；相对而言，慢病毒载体的插入温和一些，引入突变的概率较低，但其转染效率有待改善。为了克服病毒载体插入突变的问题，非病毒载体转染方式受到了关注。但常用的电转法转染的CAR 结构不会整合进入基因组，只能短暂表达，持续3 d 左右[21]。随着基因编辑技术的进步，已开发出多种可以使外源基因稳定表达的编辑技术，如睡美人转座子、TALEN、CRISPR 等[56]，有望在今后将这些技术应用于CAR-NK 细胞的构建。此外，NK 细胞的生命周期短暂，NK-92 细胞系在使用前需要辐照，这些特点避免了持续杀伤含有肿瘤相关抗原的正常细胞，但也影响了CAR-NK 细胞治疗的有效性。

5 结语

我们正处于细胞治疗快速发展的元年，人类终于看到了战胜肿瘤的希望。但是，仍然有许多问题等待着我们。相对于CAR-T的巨大成功，NK 细胞在理论上存在的优势是否在临床试验中能够得以验证，成为另一种便捷有效的即用型细胞产品，补充甚至是替代CAR-T 呢？另外，CARNK 目前面临的许多问题，如NK 细胞来源选择、CAR 结构的取舍、转染方式的改善等，都需要得到解决。相信随着理论知识的完善，临床研究的进行和联合治疗的发展，CAR-NK 细胞的治疗方法在今后必然会占据一方舞台。