采用分子生物学技术诊断隐球菌脑膜脑炎的研究

王光裕 陈敏 洪南 王升启 廖万清 杨英

(1.军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；2.上海市医学真菌分子生物学重点实验室；上海长征医院皮肤科，上海 200003；3.北京市药品检验所，北京 100035)

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂和糖皮质激素在临床的大量使用，肿瘤、艾滋病、骨髓移植和器官移植等免疫缺陷患者继发侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的病例数量不断上升，有研究表明，侵袭性真菌感染患者的死亡率超过50%[1,2]，早期确诊对于治愈患者、降低死亡率有非常重要的意义。

传统的真菌实验室诊断方法包括真菌镜检、培养以及组织病理学检查等。分子诊断技术的快速发展为IFI的诊断带来了一场分子微生物学革命，通过对疾病早期病原体的微量核酸进行检测，能快速进行鉴定，从而指导治疗。与传统方法相比，分子诊断技术大大缩短了诊断所需时间，敏感性和特异性也大幅提高，且操作简便，易于重复，有利于规范化，为IFI的快速诊断提供了新的思路[3-5]。

本病案为1例临床上难以判定病因的脑膜炎患者，曾考虑代谢性疾病、脱髓鞘疾病或结核性脑膜炎，但相应治疗效果不明显。后考虑为隐球菌感染可能，经脑脊液墨汁染色未发现典型的隐球菌荚膜特征；进行多次微生物培养，均未成功。最后通过对脑脊液样本直接提取DNA进行PCR和DNA芯片的快速检测，确定脑脊液中有隐球菌感染，并指导临床用药，使患者病情缓解。

1 材料和方法

1.1 实验材料

样本 患者脑脊液样本由长征医院提供。

试剂 DNA提取试剂(美国Zymo公司，ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)。PCR实验相关试剂：PCR Mix(捷瑞生物工程有限公司)；ITS引物(捷瑞生物工程有限公司)，ITS4序列为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5序列为5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；琼脂糖(美国 Lonza公司)；50×TAE(天根生化科技有限公司)。DNA芯片相关试剂耗材：醛基化玻片(上海百傲科技有限公司)；杂交液(组分为：4×SSC，0.3% SDS，5%甲酰胺，5×Denhardt)。银染试剂：显色A液(醋酸银的水溶液，浓度4 mg/mL)；显色B液(氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度10 mg/mL)。标记液：Streptavidin-HRP(Sigma)与稀释液(1×BS+0.1%BSA)按照1∶1000的比例进行稀释得到。量子点工作液：Streptavidin-Nanogold原液(Nanoprobes)与稀释液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶40的比例稀释。底物液：Biotin-Tyramine与稀释液(1×PBS+0.1%BSA)按照1∶500的比例进行稀释。5mL 50×Denhardts试剂：取50mg BSA、50mg Ficoll和50mg PVP，加5 mL水溶解，混匀。PBS缓冲液：800 mL水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加水定容至1 L，高压灭菌，保存于室温。10% SDS：10 g SDS用去离子水溶解，定容至100 mL。20×PBST：取160 g NaCl，4g KCl，28.8 Na2HPO4，4.8 g KH2PO4，10 mL吐温20，加水至1000 mL，振荡混匀。20×SSC：称取175.2g NaCl, 88.2 g柠檬酸钠，溶于800 mL去离子水中，加入数滴10 mol/LNaOH溶液，调节PH至7.0，加去离子水定容至1L，分装后灭菌，10×SSC、5×SSC、1×SSC可由20×SSC做相应稀释得到。

仪器 全自动样本快速研磨仪(中国上海净信科技有限公司)；离心机(美国Thermo公司)；涡旋振荡器(中国其林贝尔公司)；恒温金属浴(中国卡尤迪公司)；NanoDrop分光光度计(德国IMPLEN公司)；Qubit 2.0 荧光计(美国Thermo Fisher公司)；E-gel凝胶电泳系统(美国Thermo Fisher公司)；PCR仪(美国ABI公司)；电泳仪(中国北京六一仪器厂)；凝胶成像仪(美国BIORAD公司)；芯片点样仪(Pix Sys 5000 Cartesian Technologies)；基因芯片扫描仪(GenePix 4000B Axon Instruments)；生物芯片便携式可视化芯片扫描仪(全军传染病分子诊断新技术重点实验室研制)。

1.2 方法

样本DNA提取 从脑脊液中提取总DNA：向ZR BashingBeadLysis Tube (0.1 mm&0.5 mm)中加入200 μL脑脊液，再加入750 μL Lysis Solution，按照试剂盒说明书操作。

PCR检测ITS序列 PCR扩增：PCR体系(Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板1 μL)。扩增条件(95℃预变性4 min后，在95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min条件下进行30个循环，72℃延伸7 min)。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段。

DNA芯片制作 针对5种常见机会性感染真菌，选取隐球菌LAC1位点、烟曲霉CYP51A位点、白念珠菌SAP6位点、马尔尼菲篮状菌GASC位点、耶氏肺孢子菌18S位点作为检测序列[6]，针对其保守区设计引物探针，最终筛选出了5对引物见表1，5条探针用于真菌检测见表2。

表1 本研究使用的引物信息及序列

表2 本研究筛选后的探针信息及序列

Multiplex RT-PCR反应条件 预变性95℃反应10 min,变性94℃反应30 s,退火温度52℃反应30 s，退火温度72℃反应30 s，设定45个循环，终延伸72℃反应5 min。

DNA芯片的杂交、洗涤及可视化检测 杂交及洗涤:PCR产物98℃热变性5 min，冰浴5 min，与杂交液等体积混合，取10 μL加至各反应区将芯片置于杂交盒，浸入45℃水浴中杂交1 h。杂交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2%SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC) 中于室温各洗涤20 s，置室温晾干。可视化检测：①在芯片反应区加入10 μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重复3次，置室温晾干。②在芯片反应区加入10 μL的生物素—酪胺(biotin-tyramine)，37℃水浴放置30 min，用PBST洗液清洗20 s，重复3次，置室温晾干。③在芯片反应区加入10 μL Nanoprobes，37℃水浴放置30 min；取出后用PBST洗液清洗20 s，重复3次，用去离子水冲洗，置室温晾干。④将银染试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入混合液30 μL，待芯片上出现明显可视化信号后停止显色，用去离子水清洗，晾干。芯片杂交信号使用便携式可视化生物芯片扫描仪进行扫描，用ArrayVision7.0软件分析结果。

2 结 果

2.1 常规检查

患者脑CT显示右侧脑膜有个白色的小亮点，疑似真菌感染形成的肉芽肿。脑脊液墨汁染色在40倍显微镜下发现疑似隐球菌孢子，但没有荚膜，与常见引起脑膜炎的新生隐球菌的形态有所差别。

2.2 脑脊液样本提取总DNA行分子诊断结果

PCR 电泳 将患者脑脊液提取的DNA进行ITS序列的扩增，其琼脂糖电泳图中见患者样本和阳性对照在600 bp左右都有明显条带，阴性对照没有条带。见图1。

DNA芯片结果 将患者脑脊液提取的DNA进行芯片检测，在新生隐球菌列显示阳性结果，见图2。

3 讨 论

ITS序列是真菌核糖体DNA序列间隔区的高度保守序列，可以依此设计引物，将扩增产物作为DNA Marker来判定样本中是否存在真菌以及真菌的种属鉴定[7]。该技术已在真菌实验室诊断中较广泛应用，Rivera等[8]采用巢式PCR技术对隐球菌的鉴定可以达到飞摩尔(fmol)级别，具有高度的灵敏性和特异性。生物芯片技术自上世纪90年代进入快速发展的阶段，至今已在诸多领域已得到广泛地应用，它可在平方厘米大小的固相介质表面或液相介质中用微加工技术构建分析系统，根据分子间相互作用的原理，实现对核酸、蛋白质等分子的快速、特异、高通量和自动化检测，在病原微生物的感染诊断、基因分型、耐药检测等方面应用广泛，已有多种生物芯片产品用于临床诊断[6,9]。

图1ITS序列的电泳图谱： “M”为DNA的marker；“-”为阴性对照；“Y”为患者样本；“+”为新生隐球菌阳性对照；“N”为空孔图2患者脑脊液提取的DNA在基因芯片上的检测结果

Fig.1Electropherogram of ITS sequences：“M” is DNA marker；“-” is Negative control; “Y” is the patient sample; “+” is theCryptococcusneonatal positive control; “N” is the empty holeFig.2Detection of DNA extracted from cerebrospinal fluid in patient on gene chips

本文患者脑脊液直接提取的DNA经过PCR扩增ITS序列，其电泳图中有与隐球菌阳性对照相对应的条带，可以初步断定其中有隐球菌的存在。但由于脑脊液墨汁染色未查见典型的隐球菌形态，所以又将脑脊液样本DNA进行了芯片检测分析进一步确证为隐球菌。

隐球菌脑膜炎诊断明确后，予两性霉素联合氟胞嘧啶及伏立康唑联合抗真菌治疗约10 d后，患者意识逐渐恢复，复查脑脊液压力、脑脊液蛋白逐渐降低，复查头颅MRI亦提示异常信号较前明显降低，考虑抗真菌治疗有效，继续予联合抗真菌治疗约6个月后停止抗真菌治疗。目前患者一般情况好，未诉头痛等异常症状，复查脑脊液及头颅MRI亦未见异常。

分子诊断技术为侵袭性真菌感染病原体的快速诊断提供了可能，基因芯片具有灵敏度高、通量高、多种微生物同时检测等特点，试验可在5 h内完成，对于用传统检验不能明确诊断的疑难、复杂感染病症的诊断有非常广阔的应用前景。