段萍萍,艾丽梅
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)以骨髓浆细胞的恶性增生为特征,是血液系统的恶性肿瘤,发病率仅次于淋巴瘤,在我国的发病率约为1/10万[1]。传统的多发性骨髓瘤治疗。方法包括化疗、放疗以及造血干细胞移植,但治疗效果不理想。多发性骨髓瘤到目前为止依然被认为是一种不可治愈的疾病[2],对大多数骨髓瘤患者的治疗目的是改善其生活质量、延长生存期。有临床研究表明:生物治疗对多发性骨髓瘤具有良好的疗效[3-4]。因此,寻找多发性骨髓瘤生物治疗的潜在靶点,已经成为目前血液系统恶性肿瘤研究的热点。
Toll样受体4(Toll like receptors 4, TL R4)是一种模式识别受体,属于Ⅰ型跨膜蛋白[5],是人类发现的第1个TLR样相关蛋白,分布于多种组织和细胞中。研究表明,TLR4通过对入侵的病原相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns, PAMP)或损伤相关分子模式(damage- associated molecular patterns,DAMP)的识别,从而启动机体的固有免疫和获得性免疫[6]。 TLR4在炎性反应、免疫和肿瘤的发生发展中具有重要的影响,能够激活Myd88/NF-κB信号通路、诱导肿瘤细胞的免疫逃逸、促进肿瘤细胞的增殖和恶化、抑制肿瘤细胞的凋亡,提示TLR4可能会成为肿瘤生物治疗的新靶点。因此,本研究观察了TLR4抑制剂TAK-242对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 增殖、凋亡的影响,并探究可能的作用机制。
人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由中国医学科学院血液病医院实验室赠予。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自加拿大ABM公司。引物合成及测序均由上海生物工程科技有限公司完成,见表1。Myd88、NF-κB、GAPDH抗体购自英国Abcam公司,TAK-242购自法国InvivoGen公司,RPMI1640培养液购自美国HyClone公司,CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所,Annexin-V/PI试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。
表1 PCR引物序列Table1 Sequences of PCR primers
1.2.1 细胞培养及分组 人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株复苏后接种于培养瓶中,采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液(青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml),于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,每2~3天换液或传代,取对数生长期细胞进行实验。将RPMI8226细胞分为A、B、C组及对照组(control),其中A、B、C组分别加入终浓度为20、40、80 μmol/L的TAK-242培养(浓度选择参考文献[7]), 对照组不加抑制剂。
1.2.2 CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率 取对数生长期RPMI8226细胞接种于96孔板,每孔6×103个细胞,每组设4个平行孔,按照上述。方法分为4组,于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24 h,培养结束前4 h每孔加入10 μl CCK-8。用自动酶联免疫检测仪检测各孔细胞在450 nm波长处的吸光度值(OD值),根据吸光度值分析细胞的增殖能力。细胞增殖抑制率=(1-OD实验组/OD对照组值)× 100%,实验重复3次,取平均值。
1.2.3 Annexin-V/PI检测各组细胞凋亡率 取对数生长期RPMI8226细胞接种于6孔板,每孔4×105个细胞,按照上述。方法分为4组,放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养,24 h后取各组细胞,用预冷PBS洗涤2次,收集细胞后加入100 μl 1×Binding Buffer重悬细胞,然后加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI Staining Solution并轻轻混匀,室温、避光条件下反应15 min 。加入400 μl 5×Binding Buffer混匀后用流式检测专用的试管收集标本,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。
1.2.4 RT-PCR检测各组细胞TLR4、Myd88 mRNA表达水平 采用1.2.3中的。方法收集细胞,用TRIzol法提取细胞总RNA,然后用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。根据ABM反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。采用20 μl RT-PCR反应体系,反应条件为:25℃ 10 min, 42℃ 50 min, 85℃ 5 min。按照ABM说明书,配制qPCR反应体系20 μl,反应条件如下:95℃预变性10 min×1;95℃变性15 s,60℃退火60 s,共40个循环。实验重复3次,2-ΔΔCt法计算TLR4、Myd88 mRNA的相对表达水平。
1.2.5 Western blot检测细胞Myd88、NF-κB的蛋白表达情况 同样的。方法收集细胞后用RIPA裂解液在冰上裂解20 min,4℃ 、12 000 r/min离心10 min后取含全蛋白的上清液,用BCA法进行蛋白定量。然后上样、电泳、转膜,采用5%BSA室温封闭2 h,TBST洗膜5 min×3次,加入Myd88、NF-κB、GAPDH的一抗(稀释比例均为1:1 000),4℃孵育过夜,TBST洗膜3遍,每次10 min。再加入二抗室温下杂交1.5 h,TBST洗膜3遍,每次10 min,应用ECL显色剂显影并保存,用Image J软件分析条带的灰度值,计算条带Myd88、NF-κB与GAPDH条带的灰度值之比。
采用SPSS16.0统计软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示,多组间的检验先采用单因素方差分析,若整体差异有统计学意义,进一步多重比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。
CCK-8结果显示,与对照组(0)比较,A、B、C三组多发性骨髓瘤细胞增殖抑制率逐渐升高,分别为(27.76±3.85)%、(47.50±2.78)%、(73.43±1.69)%,差异均有统计学意义(P=0.000)。提示TLR4抑制剂具有抑制RPMI8226细胞增殖的作用,见图1。
图1 CCK-8法检测不同浓度抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的抑制作用Figurel Inhibition effect of TAK-242 at different concentrations on proliferation of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 detected by CCK-8 assay
流式细胞术检测结果显示,经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后,随着抑制作用浓度的增加,多发性骨髓瘤细胞凋亡率逐渐升高,分别为A组(34.67±5.03)%、B组(42.33±2.52)%、C组(55.67±5.13)%,各浓度组与对照组(19.67±2.52)%之间的凋亡率差异有统计学意义(P=0.000)。提示TLR4抑制剂具有促进RPMI8226细胞凋亡的作用,见图2。
结果显示,经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后,随着抑制作用浓度的增加,TLR4、Myd88 mRNA相对表达量逐渐降低,各浓度组与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。其中,C组TLR4、Myd88 mRNA相对表达量明显降低(P=0.049、P=0.014),A组、B组TLR4、Myd88 mRNA相对表达量显著降低(P=0.000),见图3。
Western blot结果显示,经不同浓度的抑制剂处理RPMI8226细胞24 h后,随着抑制作用浓度的增加,Myd88、NF-κB的蛋白相对表达量逐渐降低,各浓度组与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。其中,B组Myd88蛋白相对表达量(P=0.000)、C组NF-κB的蛋白相对表达量(P=0.002)显著降低,见图4。
图2 流式细胞术检测不同浓度抑制剂作用24h后人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的凋亡率Figure2 Apoptosis rate of human multiple myeloma cell lines RPMI8226 after 24h of TAK-242 treatment at different concentrations detected by fl ow cytometry
图3 RT-PCR检测不同浓度抑制剂作用后人多发性骨髓瘤细胞TLR4、Myd88 mRNA的表达水平Figure3 TLR4 and Myd88 mRNA expression in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by RT-PCR
图4 Western blot检测不同浓度抑制剂作用后人多发性骨髓瘤细胞Myd88、NF-κB的蛋白表达情况Figure4 Expression of Myd88 and NF-κB in human multiple myeloma cells treated with different concentrations of TAK-242 detected by Western blot
TLR4是人类发现的第一个跨膜信号转导受体家族(TLRs)相关性蛋白,在TLRs中占有重要位置,其结构分为3部分:胞内段、跨膜区、胞外段,可以调控共刺激信号分子和细胞因子的表达,也可以调控细胞的增殖、凋亡以及肿瘤微环境的形成。TLR4信号通路有两条:一条为Myd88依赖性信号途径,另一条为Myd88非依赖性转导途径[8],其中以Myd88依赖性转导途径最为常见。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,Myd88)是一种含有TIR结构域的接头蛋白,被认为是TLR4信号转导过程中最重要的接头蛋白。它的本质是一种细胞质可溶性蛋白,是Toll样信号通路中最关键的衔接分子[9]。Myd88依赖性信号途径通过激活Myd88,最终开启MAPK和NF-κB信号通路,以及促炎性反应因子、共刺激分子的表达;Myd88非依赖性信号途径则不依赖于Myd88蛋白的激活,主要是通过干扰素调节因子3(IFN regulatory factor 3, IRF-3)来延迟性激活NF-κB的活性。TLR4信号通路在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤细胞中的作用被广泛报道[10-13],而在多发性骨髓瘤中的表达和意义及其作用机制较少有文献报道。
TLR4是近些年肿瘤免疫学领域的研究热点,靶向TLR4的小分子特异性抑制剂有望成为肿瘤治疗的新药[14]。TAK-242是TLR4胞内结构域的选择性特异性抑制剂[15-16],目前已经证实了其在体外细胞培养实验中具有抗肿瘤的作用[17],但是对于其在多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡中的作用目前尚无相关报道。
为了明确TLR4信号通路在多发性骨髓瘤进展中的作用,本研究经不同浓度的TLR4抑制剂处理多发性骨髓瘤RPMI8226细胞,结果显示,实验组细胞TLR4、Myd88 mRNA表达水平降低,同时Myd88、NF-κB蛋白表达量也降低,提示通过抑制TLR4信号通路可以显著抑制NF-κB的表达水平,与2016年Gao等[18]的报道相似。NF-κB是一种氧化还原敏感蛋白复合物,是调节炎性反应过程的关键转录因子,在炎性和免疫反应中起重要作用。在正常情况下,通常NF-κB以与p50、p65结合形成异二聚体的形式存在,并且与NF-κB抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB, IκB)结合形成三聚体,滞留在细胞质中,TLR4信号通路被激活后,IκB发生磷酸化,进而和NF-κB解离,三聚体被降解,NF-κB由此活化后迁移进入细胞核内,活化并启动包括TNF-α、IL-1β、IL-6在内的多种炎性反应介质的表达,完成信号通路转导,然而炎性细胞因子的产生会反过来激活NF-κB,炎性反应被放大,由此引发炎性反应的级联作用。因此,NF-κB在炎性反应和免疫反应中起着非常重要的调控作用[19],而大多数癌症的发生、发展往往与NF-κB介导的炎性反应通路有着密不可分的联系[20]。此外,NF-κB信号转导通路与细胞凋亡也密切相关[21]。NF-κB被活化后通过对凋亡基因的调控,进而调控下游蛋白表达来参与细胞的凋亡过程,最终导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3)的活化,Caspase-3的激活是细胞凋亡过程的最后关键步骤。以往研究发现,TLR4信号通路对多发性骨髓的增殖和凋亡起重要作用[22-33]。本研究结果表明,TLR4信号通路被抑制后,多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制率、凋亡率均增高,且随TAK-242浓度的升高,细胞增殖抑制率、凋亡率亦随之增高,说明TAK-242可抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡。
综上所述,To l l样受体4特异性抑制剂TAK-242可抑制人多发性骨髓瘤细胞的增殖、促进细胞凋亡,其机制可能为抑制TLR4/Myd88/NF-κB信号通路,提示阻断TLR4可能是治疗多发性骨髓瘤的潜在。方法,未来需在动物实验中进一步实验去验证TAK-242对人多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的影响。