紫草素对荷肝癌裸小鼠移植瘤生长的抑制作用及机制

武向丽

作者单位：邯郸市中心医院药学部，河北 邯郸 056001

肝癌是全球及我国发病率和致死率均较高的恶性肿瘤之一，于我国致死率居恶性肿瘤第二位。紫草素是我国传统中药品种紫草的活性成分之一，具有增强免疫力、抑制炎症反应等多方面药理学作用［1-2］，已见文献报道紫草素对乳腺癌、子宫内膜癌、白血病、宫颈癌、喉癌等部位肿瘤生长都具有一定的抑制作用［3-7］，但紫草素是否对肝癌生长具有抑制作用的文献报道尚不多见，本研究将对这一问题进行研究分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物和实验细胞本研究时间为2016年4—8月，选取4～6周龄Balb/C品系裸小鼠，雄性、体质量范围为18～22 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）2017-0005］提供；所有实验操作均符合一般动物伦理学要求。人肝癌HepG2细胞株由河北医科大学细胞生物研究室惠赠。

1.2 药物与试剂紫草素（中国药品生物制品检定所，批号110769-201603，纯度≥98%）；注射用顺铂［齐鲁制药（海南）有限公司，10 mg/支，批号1602016］；HE、TUNEL试剂盒购自南京建成生物研究所（批号分别为20141123、20140918）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相关X蛋白质（Bax、bcl-2）抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号201501006、201410013、201405009）。

1.3 荷肝癌裸小鼠模型的制备、分组与给药参照谢丹等［8］报道的方法制备荷肝癌裸小鼠模型人肝癌HepG2细胞株经解冻复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养，取对数生长期细胞并调整其浓度为2×107个/mL，于右后腿外侧皮下注射0.5 mL浓度为2×107个/mL的细胞溶液，以一周后右后腿外侧皮下出现＞0.3 cm2移植瘤为模型复制成功。取模型裸小鼠设模型组，紫草素低、中、高剂量组和顺铂组，每组12只，分别隔天一次给予0.9%氯化钠溶液，紫草素0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg和顺铂2 mg/kg，共给药6次。

1.4 观察动物生存状态和抑制率组织生长状态观察各组裸小鼠食欲、精神状态等；观察各组裸小鼠抑制率瘤体大小、活动度、硬度等指标。

1.5 瘤量和抑瘤率颈椎脱臼处死动物后剥取肿瘤组织并称重，抑瘤率（%）＝（模型组瘤重－治疗组瘤重）/模型组瘤重×100%。

1.6 肿瘤组织形态检查和细胞凋亡状况观察称重后瘤体经4%多聚甲醛溶液固定72 h后进行石蜡包埋、切片、展片、水化等处理后，①行HE染色后封片，倒置光学显微镜观察肿瘤组织形态结构；②依照TUNEL试剂盒操作步骤进行处理，倒置光学显微镜观察细胞凋亡状况（细胞核黄染为细胞凋亡指征），凋亡指数（Apoptosis Index，AI）（%）＝（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

1.7 凋亡相关蛋白表达取1.6步骤水化处理后切片，采用IHC法检测凋亡相关蛋白［半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、bcl-2相关X蛋白质（Bax、bcl-2）］表达；蛋白表达量通过半定量分析计算：每张切片随机选取互不重叠的5个视野，通过图像分析软件计算每个视野光密度值（OD），以OD值代表蛋白表达密度，并进一步计算Bax/bcl-2表达比值。

1.8 统计学方法运用SPSS 13.0进行数理统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸小鼠生存状态及肿瘤特征观察结果模型组裸小鼠精神萎靡、食欲不振，移植瘤呈质硬、活动性强、与胸壁不粘连等特征。紫草素低、中、高剂量组和顺铂组裸小鼠食欲和精神状态较模型组均明显改善，瘤体积小、活动度低、硬度低，紫草素干预作用具有一定剂量依赖性。

2.2 各组裸小鼠移植瘤瘤体质量和抑瘤率与模型组比较发现经紫草素中、高剂量组和顺铂治疗能够显著降低荷肝癌裸小鼠移植瘤质量，差异有统计学意义（P＜0.05），经紫草素低、中、高剂量组或顺铂治疗能够显著提高抑瘤率，差异有统计学意义（P＜0.01）；紫草素高剂量组和顺铂组比较瘤重、抑瘤率，均差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 紫草素对荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤体质量和抑瘤率的影响/±s

表1 紫草素对荷肝癌裸小鼠移植瘤瘤体质量和抑瘤率的影响/±s

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组别模型组紫草素低剂量组紫草素中剂量组紫草素高剂量组顺铂组F值P值鼠数12 12 12 12 12瘤体质量/g 1.69±0.14 1.32±0.21 1.18±0.17a 0.83±0.12b 0.76±0.11b 72.509 0.000抑瘤率/%0.00±0.00 21.89±3.75b 30.18±4.92b 50.89±6.43b 55.03±8.17b 194.686 0.000

2.3 各组裸小鼠肿瘤组织形态结构结果如图1所示：与模型组比较发现，经紫草素低、中、高剂量组或顺铂干预治疗后，肝癌移植瘤组织呈现片状坏死病变，移植瘤组织细胞数量减少、间隙增大，上述作用呈一定剂量依赖性。

2.4 各组裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡状况结果如图2所示：与模型组比较发现，经紫草素各剂量或顺铂干预治疗后荷肝癌裸小鼠移植瘤组织凋亡细胞数量明显增多，以紫草素高剂量组效果最为显著。凋亡指数（AI）计算结果：与模型组比较，紫草素低、中、高剂量组和顺铂组AI均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；紫草素高剂量组和顺铂组比较，紫草素高剂量组AI显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 紫草素对荷肝癌裸小鼠肿瘤组织细胞AI的影响

2.5 各组裸小鼠移植瘤caspase-3蛋白表达较模型组，经紫草素低、中、高剂量组或顺铂组治疗后荷肝癌裸小鼠移植瘤组织中caspase-3蛋白表达显著上调，以紫草素2 mg/kg组效果最为显著；见图3。半定量分析结果：较模型组，紫草素低、中、高剂量组和顺铂组移植瘤组织caspase-3蛋白表达OD值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。紫草素高剂量组和顺铂组比较caspase-3蛋白表达OD值，紫草素高剂量组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.6 各组裸小鼠移植瘤组织Bax、bcl-2蛋白表达及Bax/bcl-2表达比值与模型组比较，紫草素低、中、高剂量组和顺铂组移植瘤组织Bax蛋白表达不同程度上调、bcl-2表达不同程度下调，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以紫草素高剂量组上述效果最为显著；见图4、图5。半定量分析结果：较模型组，紫草素低、中、高剂量组和顺铂组裸小鼠移植瘤Bax表达OD值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），紫草素中、高剂量组和顺铂组bcl-2表达OD值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），紫草素低、中、高剂量组和顺铂组Bax/bcl-2表达比值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；紫草素高剂量组和顺铂组比较，紫草素高剂量组Bax/bcl-2表达比值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），Bax、bcl-2蛋白表达OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3、Bax、bcl-2表达OD值及Bax/bcl-2表达比值/±s

表3 各组裸小鼠移植瘤组织中caspase-3、Bax、bcl-2表达OD值及Bax/bcl-2表达比值/±s

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与顺铂组比较，cP＜0.05

组别模型组紫草素低剂量组紫草素中剂量组紫草素高剂量组顺铂组F值P值鼠数12 12 12 12 12 caspase-3（OD）0.05±0.02 0.16±0.05a 0.21±0.04b 0.27±0.06bc 0.15±0.04a 37.423 0.000 Bax（OD）0.29±0.05 0.54±0.10b 0.63±0.15b 0.81±0.21b 0.74±0.14b 23.766 0.000 bcl-2（OD）0.50±0.07 0.46±0.11 0.37±0.05a 0.30±0.05b 0.39±0.07a 11.979 0.001 Bax/bcl-2 0.59±0.20 1.17±0.25a 1.70±0.39b 2.71±0.68bc 1.89±0.43b 41.591 0.000

3 讨论

肝癌是一种转移能力和侵袭其它器官组织能力都比较强的癌种之一［9-10］，并且因为肝癌发病较为隐匿，多数病人确诊时已错过手术机会［11］，5年复发率达60%，因此延缓肝癌肿瘤生长、延长病人生存期是临床上迫切需要解决的医学难题。

紫草素是一种萘醌类化合物，近年来研究发现紫草素具有抑制多部位肿瘤生长的作用，能够通过促进内源性活性氧合成而抑制人宫颈癌Hela细胞增殖［5］、通过调节细胞周期时相而抑制喉癌细胞增殖［6］、促进人乳腺癌MCF-7细胞自噬［3］、促进抑制白血病HL-60细胞凋亡并抑制增殖［7］。本实验结果显示，紫草素能够明显改善荷肝癌裸小鼠食欲和精神状态、减慢移植瘤生长、降低瘤体硬度、降低瘤体活动度，诱导移植瘤组织片状坏死、促进肿瘤细胞凋亡，说明紫草素具有抑制荷肝癌裸小鼠移植瘤生长的作用。

细胞凋亡是细胞的一种自助程序性死亡模式，caspase-3、Bax、bcl-2三种蛋白在细胞凋亡过程中发挥着重要调节作用。其中caspase-3蛋白为凋亡刺激因子，为细胞凋亡的“激活器”，Bax能够改变线粒体膜通透性、促进细胞色素C释放而诱导细胞凋亡［12］，bcl-2能够通过抑制caspase-3活性、保护线粒体膜而抑制细胞凋亡［13-15］。此外，Bax蛋白和bcl-2蛋白能够形成同源二聚体而相互抑制二者活性，因此Bax/bcl-2蛋白表达比值能够反应二者对细胞凋亡的真实调节作用［16］。本实验结果显示，紫草素能够上调移植瘤组织caspase-3、Bax蛋白表达并下调bcl-2蛋白表达，提高Bax/bcl-2表达比值。

综上所述，紫草素具有抑制肝癌裸小鼠移植瘤生长的作用，紫草素调节凋亡相关蛋白表达而促进肿瘤细胞凋亡可能是该作用重要的分子机制。

（本文图1～5见插图5-1）

图1 紫草素对荷肝癌裸小鼠肿瘤组织形态结构改变的影响（HE×200倍）：A-模型组；B-紫草素0.5 mg/kg组；C-紫草素1 mg/kg组；D-紫草素2 mg/kg组；E-顺铂2 mg/kg组

图2 各组裸小鼠肿瘤组织细胞凋亡状况（TUNEL×200倍）：A-模型组；B-紫草素0.5 mg/kg组；C-紫草素1 mg/kg组；D-紫草素2 mg/kg组；E-顺铂2 mg/kg组

图3 各组裸小鼠移植瘤组织caspase-3蛋白表达（IHC×200倍）：A-模型组；B-紫草素0.5 mg/kg组；C-紫草素1 mg/kg组；D-紫草素2 mg/kg组；E-顺铂2 mg/kg组

图4 各组裸小鼠移植瘤组织Bax蛋白表达（IHC×200倍）：A-模型组；B-紫草素0.5 mg/kg组；C-紫草素1 mg/kg组；D-紫草素2 mg/kg组；E-顺铂2 mg/kg组

图5 各组裸小鼠移植瘤组织bcl-2蛋白表达（IHC×200倍）：A-模型组；B-紫草素0.5 mg/kg组；C-紫草素1 mg/kg组；D-紫草素2 mg/kg组；E-顺铂2 mg/kg组