慢性哮喘小鼠肺组织中组蛋白乙酰化修饰位点 H2BK16ac 表达增强

任媛，苏新明，陆常玲，李朋，李孟露，白诗瑶，康健

(中国医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，沈阳，110001)

慢性哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的气道炎症性疾病，主要表现为反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽等症状，其发病与肺组织中细胞因子、炎性介质及相关酶类等众多因素的异常密切相关[1]。研究发现组蛋白乙酰化、甲基化、泛素化等修饰在调控哮喘炎症基因表达过程中发挥了重要作用，尤其是组蛋白乙酰化修饰通过改变染色质的空间构象，在调控基因转录激活、延伸、表达等方面不可或缺[2,3]。然而组蛋白上存在许多潜在的乙酰化位点，不同位点的乙酰化修饰活化后的作用并不完全相同[4]。本次研究旨在明确慢性哮喘时组蛋白乙酰化位点H2BK16ac 的表达变化，以期为阐明H2BK16ac与慢性哮喘之间的关系提供依据。

材料和方法

1 慢性哮喘模型小鼠的制备及分组

6～8 周SPF 级 雌 性BALB/C 小 鼠 购 自 辽 宁长生生物技术有限公司[动物许可证号：SCXK(辽)2010-0001]。随机分为正常组和慢性哮喘组，12只/组。于实验第0、7、14 天，慢性哮喘组小鼠予以卵蛋白OVA（20μg）和氢氧化铝凝胶（2mg）混悬液腹腔注射致敏。末次致敏7d 后，OVA（20mg/ml）超声雾化（3ml/min）8 周，3 次/周，30min/次。正常组均用等量生理盐水代替OVA 处理。

2 HE 染色观察气道炎症浸润

取小鼠左侧肺组织制成0.5μm 石蜡切片用于病理染色。石蜡切片脱蜡水化，苏木素染5min，洗去浮色后，盐酸酒精分化3s，流水返蓝20min，伊红复染2min，洗去浮色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察小鼠气道肺组织炎症浸润水平。

3 AB-PAS 染色观察气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌情况

石蜡切片脱蜡至水，3%醋酸洗2min，阿利新兰染10min，蒸馏水洗去浮色，0.5%过碘酸染5min，蒸馏水洗去浮色，70%酒精洗，Schiff氏染15min，流水冲洗10min，苏木素染核5min，水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察气道上皮杯状细胞增生改变及黏液分泌情况。

4 Masson 染色观察上皮下胶原沉积

石蜡切片脱蜡水化，Masson 复合染液染5min，0.2%醋酸洗去浮色，5%钨钼酸染10min，0.2%醋酸水溶液洗2 次，苯胺蓝染色5min，0.2%醋酸水洗2 次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察上皮下胶原沉积。

5 Western blot

取小鼠右侧新鲜肺组织50mg 充分裂解、匀浆后，4℃下12000g 离心取上清。BCA 试剂盒检测蛋白浓度，调整浓度后加热变性，SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳（80V，30min；120V，90min），转膜（0.25A, 60min），脱脂奶粉室温封闭2h。H2BK16ac 多克隆兔源性抗体（1:1000，杭州景杰生物科技）4℃孵育过夜。辣根酶标记山羊抗兔二抗（北京中山金桥生物技术有限公司）室温孵育1h，ECL 法检测蛋白表达，UVP 系统成像，Gel-Pro Analyzer 凝胶定量分析软件进行结果分析。

6 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡水化，3% H2O2室温孵育5min，PBS 洗3 次，5min/次；微波修复4 次，6min/次，待回复至室温后PBS 洗3 次，5min/次；10% BSA 室温孵育30min，H2BK16ac 兔源性多克隆抗体（1:1000，杭州景杰生物科技）4℃孵育过夜。辣根酶标记山羊抗兔二抗（北京中山金桥生物技术有限公司，1:500）37℃ 孵育60min，PBS 洗3 次，5min/次；DAB 显色3min 后终止显色，流水冲洗，苏木素染核，盐酸酒精分化2s，流水20min 返蓝后脱水、透明、封片。光镜下观察H2BK16ac 在肺组织中的表达分布。

7 统计学分析

所有数据均用±s形式表示，应用SPSS19.0统计软件进行统计分析，组间均数的比较采用独立样本t检验，显著性标准为P＜0.05。

结 果

1 成功构建慢性哮喘小鼠模型

OVA 雾化8 周后，HE 染色在小鼠气道、血管周围可见大量炎症细胞聚集，部分气道管腔纤毛脱落（图1A）；PAS 染色可见小鼠气道纤毛上皮粘膜表面被黏液覆盖，杯状细胞明显增多（图1B）；Masson 染色可见气道及血管周围大量胶原沉积，上皮下纤维明显增多（图1C）。表明建模慢性哮喘小鼠模型成功。

2 慢性哮喘小鼠肺组织中H2BK16ac 水平升高

Western blot 检测显示，慢性哮喘小鼠肺组织中H2BK16ac 水平较正常小鼠显著升高，约为正常小鼠肺组织中H2BK16ac 水平的3.5 倍（图2）。

图1 慢性哮喘小鼠肺组织组织学检测。 HE 染色观察气道炎症浸润； AB-PAS 染色观察气道杯状细胞增生； Masson 染色观察上皮下胶原沉积。比例尺，50μmFig. 1 Histological examination of the lung tissues of the mice with chronic asthma. HE staining observed airway inflammatory infiltration； AB-PAS staining observed mucus secretion； Masson staining observed subepithelial collagen deposition； scale bar, 100μm

图2 Western Blot 检测肺组织中H2BK16ac 水平。A，H2BK16ac 水平的代表性Western blot 检测结果；B，H2BK16ac 水平的统计学分析； *，与正常组比较，P＜0.01Fig. 2 Detection for expression level of H2BK16ac in the lung tissue. A, representative results of H2BK16ac level detected by Western blot； B, statistical analysis for level of H2BK16ac detected by Western blot； *, P＜0.01, compared with the normal

3 慢性哮喘小鼠气道纤毛柱状上皮细胞、气道血管周围炎症细胞和血管平滑肌细胞中H2BK16ac 免疫反应性增强

正常小鼠气道纤毛柱状上皮细胞未见H2BK-16ac 表达（图3A），慢性哮喘组小鼠气道纤毛柱状上皮细胞细胞核中高表达H2BK16ac（图3B）；正常小鼠气道血管周围未发现炎症细胞浸润（图3A），慢性哮喘小鼠肺组织中可见大量炎症细胞包绕在气道及血管周围，且部分炎症细胞的细胞核中可见H2BK16ac 免疫阳性反应（图3B）；正常小鼠肺组织各级血管的平滑肌细胞中未见H2BK16ac 表达（图3C、3E），慢性哮喘小鼠各级血管的平滑肌细胞中H2BK16ac免疫反应呈强阳性，尤其在新生或重塑的血管周围H2BK16ac 表达水平明显升高（图3D、3F）。

图3 肺组织中H2BK16ac 水平的免疫组织化学检测。黑粗箭头，气道周围炎症细胞；红粗箭头，纤毛柱状上皮细胞；黑细箭头，血管平滑肌细胞；红细箭头，新生血管平滑肌细胞；比例尺，200μmFig. 3 Immunohistochemical examination for H2BK16ac level in the lung tissues. black thick arrows, inflammatory cells around the airway； red thick arrows, ciliated columnar epithelial cells； black thin arrows, vascular smooth muscle cells； red thin arrows, neovascular smooth muscle cells； scale bar, 200μm

讨 论

为明确哮喘致病时肺组织中组蛋白乙酰化修饰位点H2BK16ac 的表达变化，我们通过OVA 致敏、激发方法构建了慢性哮喘小鼠模型。HE、PAS 和Masson 染色发现， OVA 雾化8 周后，小鼠气道血管周围大量炎症细胞浸润，部分气道管腔纤毛脱落，纤毛上皮粘膜表面黏液覆盖，杯状细胞增生，气道及血管周围大量胶原沉积，上皮下纤维明显增多，具有慢性哮喘的主要特点，表明构建小鼠模型成功。为进一步探讨乙酰化修饰位点H2BK16ac 与慢性哮喘之间的关系，我们采用Western blot 检测发现慢性哮喘时肺组织中H2BK16ac 表达水平明显增多，免疫组织化学染色结果显示慢性哮喘时H2BK16ac 高表达于肺组织气道纤毛柱状上皮细胞、气道及血管旁炎症细胞和血管平滑肌细胞，尤其在新生或重塑的血管周围H2BK16ac 表达水平明显升高。众所周知，慢性哮喘时嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞、气道上皮细胞、平滑肌细胞等众多细胞均被激活，参与气道炎症、气道重塑和气道高反应的发生[5]。同时，慢性哮喘时肺组织中血管平滑肌的表型、结构和功能均有不同程度的改变，参与血管再生和重塑的发生[6,7]。综合H2BK16ac 在慢性哮喘肺组织中的表达分布，我们推测H2BK16ac 很可能与慢性哮喘时上述细胞异常的基因表达有关。

组蛋白的乙酰化修饰在染色质重塑和基因表达过程中发挥重要作用，组蛋白乙酰基转移酶通过乙酰化修饰，使得基因启动子区的可接近性增加，促进转录因子与DNA 的结合，启动转录和DNA 表达[8]。然而在组蛋白八聚体中存在众多的乙酰化修饰位点，各个位点的作用和保守性并不完全一致，其中H3 和H4 上乙酰化位点相对保守，如H3K9、H3K14、H3K18、H3K23、H4K5、H4K8、H4K12等，而H2A 和H2B 上乙酰化位点则相对不保守[9]。近年来组蛋白上相关位点乙酰化修饰在各种病理生理过程中发挥的作用越来越受到重视[10,11]。Cui 等[12]发现慢性哮喘时肺组织中CD4+T 淋巴细胞中H3K9、H3K14、H3K27、H3K18、H4K16 的乙酰化修饰水平升高，与Notch1 启动子表观遗传状态密切相关。Iwanowycz 和Zsolt 等[13,14]发现H3K27 的乙酰化修饰水平直接影响巨噬细胞启动子区M1 型和M2 型转录因子（STAT1 和STST6）的结合水平，调控其下游基因的转录激活，最终影响巨噬细胞M1/M2 极化过程。

综上所述，H2BK16 的乙酰化修饰很可能与慢性哮喘时异常基因表达密切相关，明确H2BK16ac所调控的下游转录因子有望从表观遗传的角度阐明慢性哮喘的发病机制，为慢性哮喘的治疗提供新的靶点。