p-CREB 在小鼠植入前胚的表达及其与2- 细胞阻滞的关系

史河秀，许颂华，王世鄂*

（1福建卫生职业技术学院基础部，福建福州 350101；2福建医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，福建福州 350108）

从新的胚胎基因组中激活基因表达为哺乳动物植入前胚正常发育和存活所必需。诱导基因表达需要一系列顺式作用因子的作用，包括转录因子及其辅助因子，这些因子结合到基因的调节区域，导致转录机制的招募。转录因子有效性或活性的调节在细胞内转录激活和整体调节中起着重要作用。cAMP反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）家族成员对于正常的植入前发育必不可少，CREB 和激活转录因子1（ATF1）的缺失导致小鼠胚胎植入期存活能力的丧失和正常发育的失败，表明这些是早期胚胎发育必需的转录因子[1,2]。但CREB 与小鼠2-细胞发育阻滞的关系尚未见报道。本实验研究活化状态的CREB（p-CREB）在小鼠植入前胚中的表达初步探讨p-CREB 在小鼠植入前胚中的作用，p-CREB 在阻滞品系昆明(Kunming，KM)小鼠与非阻滞品系(B6C3F1)小鼠体外培养2-细胞胚以及B6C3F1 小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚中的表达差异，探讨其与2-细胞阻滞的关系。

材料与方法

1 实验动物

KM 小 鼠、C57BL/6 雌 鼠 和C3H/He 雄 鼠 购自上海斯莱克实验动物有限公司。B6C3F1 小鼠由C57BL/6 雌鼠和C3H/He 雄鼠杂交培育所得[3]。

2 主要试剂和仪器

Phospho-CREB (Ser133)（p-CREB）兔多克隆抗体（Cell signaling），Alexa Fluor 555 标记山羊抗兔IgG（碧云天），DAPI（碧云天），孕马血清促性腺激素（PMSG）（Sigma），人绒毛膜促性腺激素（hCG）（ProSpec TechnoGene），激光扫描共聚焦显微镜（Leica SP5）。

3 植入前胚收集

雌性B6C3F1 和KM 小鼠腹腔注射 5IU PMSG，48h 后注射 5IU hCG，随后均与雄性KM 小鼠1:1合笼，次日检查阴栓，有阴栓者视为已受精供本实验使用[3]。小鼠1-细胞胚、2-细胞胚、4-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚和囊胚分别于hCG 注射后27h、42h、54h、64h、72h、90h，用M2 培养液从雌鼠输卵管（前期阶段）或子宫（桑椹胚和囊胚）中冲洗获得。

4 体外培养2-细胞胚收集

上述方法获取的1-细胞胚，经 M2 洗涤，M16培养液漂洗3 次，挑取形态完好的1-细胞胚到预孵育的M16 培养微滴中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，于hCG 注射后42h 收集2-细胞胚。

5 激光扫描共聚焦显微镜检测

上述方法获取的植入前胚，经0.3%PVP-PBS 清洗3 次，固定液中室温固定1h，清洗3 次后于0.25% Triton X-100 液中室温通透1h，阻断液清洗3 次，阻断液中预孵育1h，p-CREB 兔多克隆抗体（1:800）4℃孵育过夜，经3 次洗涤后于Alexa Fluor 555 标记山羊抗兔IgG（1:400）避光室温孵育1h，经3 次洗涤后置入DAPI 染液中（1:10000）室温孵育1h，洗涤3 次。经洗涤后移入激光扫描共聚焦显微镜专用玻底培养皿的0.3% PVP-PBS 液滴中，于激光扫描共聚焦显微镜下观察。543nm 波长激发检测细胞内Alexa Fluor 555 红色荧光，获取p-CREB 荧光成像；405nm 波长激发DAPI 蓝色荧光，获取细胞核荧光成像。

6 统计学处理

激光扫描共聚焦显微镜所得数据使用Graphpad Prism 8.0 软件进行统计分析和做统计图，采用方差分析法分析多样本之间的差异，采用两独立样本t检验法比较两组之间的差异，以P＜0.05 为具有统计学意义。每次实验各比较组同一时间同一条件进行，各组2-细胞胚的数量在16～25 枚之间。

结 果

1 p-CREB 在小鼠植入前胚内的分布

激光扫描共聚焦显微镜结果显示：p-CREB 免疫阳性反应呈红色荧光，胞核与DAPI 结合呈蓝色荧光，p-CREB 在1-细胞胚中主要定位于细胞质中；2-细胞胚、4 细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚和囊胚中主要定位于细胞核内，少量分布于细胞质；8-细胞胚和桑椹胚的细胞核内荧光强度高于前期早胚，囊胚整体荧光强度较高（图1）。

2 p-CREB 在B6C3F1 和KM 小鼠2-细胞胚中的表达

p-CREB 在B6C3F1 和KM 小鼠体外培养2-细胞胚内的定位基本一致，均主要定位于细胞核内（图2A）。KM 小鼠体外培养2-细胞胚核内p-CREB荧光强度显著低于B6C3F1 小鼠体外培养组（P＜0.01）；B6C3F1 小鼠体外培养2-细胞胚核内p-CREB的荧光强度显著高于B6C3F1 小鼠体内发育组（P＜0.01）（图2A、2B）。

图1 p-CREB 在B6C3F1 小鼠植入前胚的分布。比例尺：15 μmFig. 1 The distribution of p-CREB in B6C3F1 mice preimplantation embryos observed by laser scanning confocal microscope. Scale bar: 15 μm

图2 p-CREB 在KM 小鼠体外培养组与B6C3F1 小鼠体外培养组以及B6C3F1 体外培养组与体内发育组的2-细胞胚核内表达比较。A，激光扫描共聚焦显微镜成像；B，p-CREB 的相对荧光强度统计图，比例尺，15 μm；* P＜0.01Fig. 2 Comparison of p-CREB expression differences in the nuclei of 2-cell embryos between KM mice and B6C3F1 mice in vitro, as well as between in vitro and in vivo of B6C3F1 mice. A, laser scanning confocal microscope images； B, statistic analysis for p-CREB immunofluorescence intensity； scale bar, 15μm； *, P＜0.01

讨 论

哺乳动物植入前胚发育问题严重限制了体外胚胎生产和辅助生殖技术的成功，虽然许多研究探索了这个问题，但它仍然有待解决。哺乳动物植入前胚的发育遵循严格的时间和空间顺序。小鼠受精的发生和第一次卵裂，卵母细胞的RNA 和蛋白质被激活并启动和调控植入前胚发育，称为母型调控；随着早胚继续发育，至2-细胞期，母源基因及蛋白开始迅速降解，此时早胚的继续发育有赖于合子基因组的激活（zygotic gene activation，ZGA），生成新的合子型的RNA 和蛋白质来支持后续的发育过程，即合子型调控。ZGA 的产物推动2-细胞胚向4-细胞胚过渡，并在4～8 细胞阶段发生中期基因组激活，并完成母型-合子型过渡。新的基因组激活产物进一步促进桑椹胚和囊胚的形成。若2-细胞期ZGA 无法顺利向4-细胞胚过渡则会在2-细胞期出现发育阻滞，称为2-细胞阻滞[4]。根据小鼠植入前胚在传统的培养基（如M16）中培养是否会产生2-细胞阻滞分为阻滞品系小鼠和非阻滞品系小鼠，其中本研究使用的KM 小鼠为阻滞品系小鼠，B6C3F1 小鼠是非阻滞品系小鼠。研究发现，降低氧自由基、改变培养液成分和在培养液中增加褪黑素等途径可提高2-细胞到4-细胞的过渡[5]，但其机制尚不完全明了。

CREB 是一种含有341 个氨基酸残基的基因转录调节蛋白，属于转录因子bZIP家族。CREB 调节转录的功能，又受到其本身磷酸化作用的调节，CREB在静止期细胞中，以去磷酸化的形式存在，当Ser133被磷酸化后为活化状态，磷酸化的CREB（p-CREB）与CRE 有高度的亲和力，与之结合后能使 CRE 下游基因的转录活性大大提高。CREB参与多种信号传导过程，调控细胞的增殖、分化、凋亡及能量代谢等，还与多种肿瘤的生长相关。胶质瘤患者中CREB1高表达提示预后不良，下调CREB1 表达则可抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力；CREB 及p-CREB 在前列腺癌组织、体外培养前列腺癌细胞PC3 及LNCap中高表达，并可上调PC3 及LNCap 中增殖相关基因PCNA 的表达，提高细胞增殖水平；p-CREB 参与了子宫内膜癌和乳腺癌的雌激素信号传导等诸多实验表明很多肿瘤的p-CREB 增高，抑制p-CREB 表达可抑制肿瘤生长；RBM10 通过RAP1/AKT/CREB 信号通路抑制肺腺癌细胞增殖[6-9]。正常的胚胎发育涉及细胞分化和增殖过程之间的平衡，这意味着CREB在胚胎发育中也起重要作用。

Jin 等发现CREB1 mRNA 在植入前胚各期均有表达，CREB1 和p-CREB1 定位于植入前胚各期的细胞质内以及2-细胞和8-细胞胚的核内；CREB 和ATF1 活化在2-细胞胚中起重要作用[2,10]。本研究结果显示，p-CREB 在整个胚胎植入前阶段都有表达，从2-细胞胚开始主要定位于植入前胚各阶段的细胞核内，而1-细胞胚则主要定位于细胞质，这些结果表明p-CREB 在整个植入前胚发育过程中起一定作用，而与Jin 的p-CREB1 定位不太一致，可能是PCREB1 以外还有较多其他类型的p-CREB 的原因。但从1-细胞胚到2-细胞胚，p-CREB 定位向核转移募集现象和Jin 研究类似，p-CREB 是一种核转录因子，要行使其功能，就需要定位在细胞核内。p-CREB的核定位在2-细胞期首次观察到明显增加，而2-细胞期的核募集刚好是ZGA 的最重要阶段。大量参与细胞增殖、存活和分化的基因的启动子含有CRE 元件（CREB 结合位点），此时p-CREB 的核定位表明它是参与ZGA 的转录因子之一，在2-细胞期发挥转录作用。另外，8-细胞期及后期的核内表达增强，提示p-CREB 在致密化和囊胚的形成以及后期胚胎发育均起重要作用。

2-细胞期也是阻滞品系小鼠发生体外发育2-细胞阻滞的时期。我们前期研究证实了KM 小鼠植入前胚体外发育时，大部分停滞在2-细胞期，即2-细胞阻滞，属于阻滞品系小鼠；而B6C3F1 小鼠是非阻滞品系小鼠[3]，我们进一步研究p-CREB 在阻滞品系KM 小鼠与非阻滞品系小鼠B6C3F1 小鼠体外培养2-细胞胚中的表达差异，结果显示，KM 小鼠体外培养2-细胞胚核内p-CREB 荧光强度显著低于B6C3F1 小鼠体外培养2-细胞胚。这表达差异提示，KM 小鼠体外发育2-细胞阻滞可能与p-CREB表达水平低相关。有研究发现，CREB 可通过作用于H2O2酶来减轻氧自由基对细胞的毒性损伤作用，从而保持氧化应激环境下的线粒体活性以促进细胞存活。Pregi 等使用cDNA 微阵列分析表明，氧化应激诱导CREB 上调，促进DNA 修复。CREB 对参与氧化损伤的DNA 修复和细胞存活有关的多种基因的表达进行调控，以介导细胞增殖并诱导细胞抗凋亡模式形成[11，12]。本研究结果也显示，B6C3F1 小鼠体外培养2-细胞胚核内p-CREB 的荧光强度显著高于B6C3F1 小鼠体内发育2-细胞胚，这可能与体外培养环境氧自由基增高等有关，体外培养环境变化促使p-CREB 表达增高来克服这种变化带来的损伤，而KM 小鼠体外培养2-细胞胚内p-CREB 表达水平低，令其无法克服体外培养环境带来的损伤而导致发育阻滞。p-CREB 以何机制克服2-细胞阻滞和促进植入前胚发育还有待进一步研究。