锌指蛋白A20在过敏性哮喘中的研究进展

袁为远，包凯帆，贾志荣，王晓钰，郑 劼，洪 敏，江国荣

(1．南京中医药大学药学院，科技部国家规范化中药药理实验室，江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023；2．南京中医药大学医学与生命科学学院药理系，江苏 南京 210023；3．南京中医药大学附属苏州市中医医院苏州市吴门医派研究院，江苏 苏州 215003)

过敏性反应是机体受到过敏原，如花粉、屋尘螨(house dust mite, HDM)等诱导后，引起的病理性组织损伤或者功能紊乱的一种免疫反应。过敏性疾病主要包括过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎等，其中患病率及复发率最高的为过敏性哮喘。据Global Burden of Disease Study资料显示，全球约有2.4亿过敏性哮喘患者，预计到2025年将达到3亿，并且有研究显示，该数值近年内将持续上升[1]。过敏性哮喘是一种变应原或其他因素引起的肺功能失常[2]，以适应性的2型辅助性T细胞(type 2 T helper cell, Th2)功能异常为主要特征的2型免疫反应。发病时，主要伴随着Th2型细胞因子白介素(interleukin, IL)-4、IL-5、IL-13的产生，表现为嗜酸性粒细胞(eosinophils, EOS)增多、黏液分泌旺盛、气道高反应性，以及E型免疫球蛋白(immunoglobulin E, IgE)的表达增加。过敏性哮喘的病因及发病机制十分复杂[3]，目前尚未被完全了解，因此，进一步研究过敏性哮喘的发病机制，并建立有效的干预或治疗手段，对于降低其发病率、复发率尤为重要。

20世纪末，美国学者Dixit等[4]通过实验，首次发现了锌指蛋白A20，因其最初是由肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)诱导内皮细胞产生的，所以又被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3, TNFAIP3)。随着对于A20的深入研究，目前它被认为是炎症信号通路的关键调控因子，主要是核转录因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)的一种负调控因子，可以通过多种途径抑制NF-κB的活化。目前已有若干报道证实，A20参与了过敏性疾病的发生和发展[5-6]，其在过敏性哮喘的发病机制中的重要作用也越来越被重视。因此，对A20与过敏性哮喘的最新研究进展进行综述，有利于为过敏性哮喘的预防和治疗提供新思路。

1 A20的起源与结构

锌指蛋白A20，根据其cDNA克隆数而命名，是一种具有高度生物活性的胞质蛋白质。研究发现，人类的A20基因序列定位于染色体中6q23.3位，其cDNA全长为4 426 bp，发挥转录活性作用的可读区域框为2 370 bp(67～2 436 bp)。人的A20蛋白总共由790个氨基酸组成，蛋白分子质量为90 ku。进一步对其蛋白结构分析可知，A20属于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBS)卵巢肿瘤(ovarian tumor, OTU)家族的一种，其N末端区(1～385)含有的半胱氨酸蛋白酶类OTU是A20蛋白的特征性结构区域之一[7]。同时，A20蛋白也具有泛素化功能，A20蛋白的锌指结构区在其C末端(386～775)，该锌指区域由7个Cys2-Cys2结构组成[8]，其中第4个结构区具有E3泛素连接酶活性，可特异性地与底物结合，招募26S蛋白酶体，将靶蛋白降解。正是因为这两种特殊的蛋白结构(Fig 1)，A20蛋白具有了泛素化和去泛素化双重功能，在炎症调节中起着重要作用。

2 A20的生物学功能

A20是一种具有高度保守性的、胞质诱导表达性蛋白，其在上皮细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等中均有表达。已有研究表明，A20作为NF-κB的负调控因子，在多种炎症性反应中扮演着重要的角色。A20蛋白可在多种促炎因子，如细菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、TNF-α、IL-1等刺激细胞后大量表达，其中，A20基因3’端非翻译区含有的4个“ATTTA”序列，是A20蛋白快速表达的基础。尽管目前广泛认为A20是一种存在于细胞质中的抗炎蛋白，但最初研究发现其是一种能够保护由TNF-α诱导细胞毒性的蛋白质。进一步研究发现，A20可以通过不同途径，抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化，除此之外，还可以抑制由CD40、IL-1，以及包括模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)等在内诱导的NF-κB的活化，并且还可以抑制T细胞和B细胞抗原受体的激活[8]。A20在多种炎症反应中起着重要作用，特异性敲除小鼠体内A20基因不久后，小鼠体内多种器官即可产生炎症反应，并且缺失A20蛋白的细胞无法阻断由刺激因子诱导的NF-κB的活化。除此之外，近年来A20还被报道能调节其他细胞信号转导通路，如Wnt通路、干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)、自噬应答等途径。研究发现，A20还可以通过直接结合白细胞介素17受体A(interleukin-17 receptor type A, IL-17RA)的C末端结构域，来抑制IL-17信号转导，并且A20可以抑制TNFR、IL-1R和NOD样受体(NOD like receptors, NLR)信号通路，但是A20是否直接与这些受体结合，尚待考证。

Fig 1 Biochemical characteristics of A20 protein

TNF受体1(TNF receptor 1, TNFR1)能够激活NF-κB活化的信号转导途径，A20被认为能通过调节该通路而成为炎症性疾病的潜在治疗靶点(Fig 2)。众所周知，蛋白质泛素化是生物体内的一种重要调节方式。该过程通过对靶蛋白进行一系列的特异性修饰后，即可招募26S蛋白酶体，将靶蛋白降解，其中起蛋白质降解标签作用的为K48多聚泛素蛋白链。除此之外，蛋白质的泛素化也可以进行信号转导，这主要依赖于K63多聚泛素蛋白链的作用，其可以被特异性的调控因子识别，启动相应信号[9]。A20被普遍认为是一种NF-κB信号的经典负调控因子，且已有文献证明，A20是一种泛素编辑酶复合体，同时具有E3泛素连接酶和DUB去泛素化酶活性。目前认为，A20抑制NF-κB信号的机制一方面是因其蛋白N末端的OTU结构域[7]，而受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacts with the protein kinase 1, RIP1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor- associated factor 6, TRAF6)和NF-κB必需调节蛋白(NF-κB- essential modulator, NEMO)等为OTU结构域的结合底物[10-12]，并且RIP1、TRAF6、NEMO等被激活后，均能募集泛素蛋白聚合，形成K63多聚泛素化链。因此，A20能够特异性地趋向K63链，破坏其多聚泛素化链完整性，从而阻断相关信号的转导[10]。除了去泛素化活性之外，A20蛋白第4个锌指结构区域ZF4所具有的泛素连接酶功能，也参与NF-κB的抑制作用。A20的E3泛素连接酶活性能促进RIP1募集以lys48位点连接为主的泛素蛋白的多聚化，也就是可以促进靶蛋白附着K48多聚泛素化链，从而招募26S蛋白酶体降解RIP1，阻断下游的信号转导。除此之外，研究还发现，A20可以通过去泛素化黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1)，负调控由T细胞受体(T cell receptor, TCR)诱导的NF-κB的活化。在淋巴细胞中，TRAF6对MALT1的泛素化也是NF-κB活化所必需的[13]。A20的生物学功能依赖于其蛋白结构基础，随着研究的发展，A20蛋白的更多功能也将会被发现。

Fig 2 A20 protein function in tumor necrosis factor receptor (TNFR)- induced NF-κB inhibition

3 A20与过敏性哮喘

过敏性哮喘是儿童和成人中最常见的慢性非传染性疾病之一，其特征是以呼吸道症状多变、气流受限为主。过敏性哮喘异质性强，是由环境和基因相互作用的结果，发病后出现严重的气道炎症和气道重塑[3]。目前，过敏性哮喘的治疗目标主要是实现对其良好的控制，尽量缓解过敏性哮喘症状，以及降低疾病复发几率。抗炎以及支气管扩张药物的使用是治疗过敏性哮喘的主要手段，尽管这些手段广泛应用于临床，但仍难以缓解恶性哮喘的发病症状，也无法防止哮喘的复发。目前，全球有很多机构都在研究过敏性哮喘，但其发病机制仍不明确。A20作为NF-κB的负调控因子，能够有效调节炎症反应，在过敏性哮喘中的研究也逐渐受到了重视。

目前，主要用于治疗过敏性哮喘的为糖皮质激素(glucocorticoid, GC)类药物，可以有效缓解气道炎症以及哮喘症状。GC既可以促进抗炎因子分泌，又可抑制许多促炎因子的表达[14]。糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是一种存在于细胞质中的转录因子，通过与GC特异性结合后转入到细胞核，参与相关基因调控。GC的治疗作用与A20的表达有关，Altonsy等[5]研究发现，特异性敲除A20后能明显增加人支气管上皮细胞分泌TNF-α，并且长效β2受体激动剂(longacting β2-adrenoceptor agonists, LABAs)能通过增加A20的表达，负调控NF-κB的活化，进而提高吸入性GC的抗炎作用。GC的抗炎作用还可通过与GR结合，促进抗炎因子A20和NFBIA基因、蛋白的表达[15]。

A20功能紊乱能够引起包括哮喘等多种免疫性疾病，但也有研究证明，A20可以限制过敏性气道炎症和耐受反应[6]。研究发现，A20参与了低剂量LPS诱导的免疫耐受。持续给予小鼠低剂量LPS，能够增强HDM诱导的哮喘小鼠的耐受性，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和肺组织匀浆中IL-4、IL-5、IL-13的表达明显减少。而特异性敲除小鼠上皮细胞A20基因(Tnfaip3EC-KO)后，可明显影响LPS诱导的免疫耐受、过敏性哮喘模型外周血中嗜酸性粒细胞数目，以及BALF和肺组织匀浆中IL-4、IL-5、IL-13表达均明显增加[6]。Tan等[16]发现，灭活的铜绿假单胞菌药剂能够通过降低Act1，以及增加TLR4、A20的表达，来抑制卵清蛋白(ovalbumin, OVA)引起的过敏性气道炎症。此外，A20也参与了锌对哮喘的调控机制。Morgan等[17]发现，短期锌处理组并未改变A20和TRAF6水平，但是导致了RIP1(IKK上游一种重要的激活因子)的降解。为进一步确定锌作为哮喘治疗剂的应用效果，随后建立过敏性气道炎症模型，给予锌治疗，结果表明锌补充剂能够通过调节A20活性而抑制NF-κB的表达，同时，补锌后可以降低气道高反应性和血清中IgE水平，但对Th2型细胞因子表达无影响。因此，补充锌可能是治疗哮喘的一种潜在方法，并且主要是通过调控A20的表达而实现的。

过敏性哮喘的发生伴随着大量Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL13的表达，在哮喘发病的初始阶段，2型固有淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cell, ILC2)是经典的，除了2型辅助性T细胞以外的Th2型细胞因子的主要来源之一。哮喘患者BALF和唾液中能够检测到大量ILC2的存在[18]，并且ILC2已被报道在炎症反应、组织修复以及代谢平衡中十分重要，因此，ILC2与过敏性哮喘关系密切。与此同时，miRNAs作为调控基因表达的重要因子，在过敏性哮喘的研究中也逐渐受到重视[19]。研究发现，miR-19a能够通过抑制ILC2中A20和SOCS1蛋白、基因的表达，从而促进IL-4、IL-5、IL-13的分泌[20]。在外源OVA诱导产生的小鼠过敏性肺部炎症模型中，当体内转染入含有A20 cDNA(Ad-A20)的腺病毒后，能够明显减少气道炎症性细胞的募集，减轻气道高反应性及支气管炎症的发生，并且Ad-A20的保护性作用是通过抑制NF-κB信号转导途径实现的。HDM诱导的过敏性哮喘小鼠肺匀浆中A20(通过调节关键信号蛋白TRAF6的泛素化来抑制TLR反应)、IRAKM(结合MyD88和TRAF6，可以阻断TLR作用，稳定信号复合物)、Tollip(与IL-1R、TLR2和TLR4相互作用以防止细胞激活，并抑制IRAK自磷酸化)均有明显增加[21]。且有报道表明，哮喘组中肺组织TGF-β1和CTCF mRNA水平与正常组相比明显上升，而体内给予外源性A20重组蛋白后明显下降，提示外源性A20对于气道上皮增生、平滑肌增殖的抑制作用与降低TGF-β1、CTCF的表达有关。

总之，目前A20均被视为一种抗炎蛋白，可以有效抑制各种炎症信号通路转导。除了传统的一些炎症信号外，近年来也发现了A20的一些新的调控因素。NLRP3作为一种炎症小体，参与了多种疾病的发生，哮喘患者体内能够检测到NLRP3的高表达，并且HDM诱导的小鼠过敏性哮喘模型中能够激活NLRP3炎症小体的组装。A20是TNF-α诱导的NF-κB信号激活通路的有效抑制剂，A20的缺失能够导致IL-1β的表达增加[22]，并且A20可以抑制NLRP3炎症小体的激活[23]，说明A20可以通过调控NLRP3的表达，缓解过敏性哮喘的炎症状态。此外，A20还可以调控一些转录因子的表达。JAK-STAT是一种经典的信号通路，膜受体活化后，能够引起JAKs的磷酸化，随后募集STATs，通过Src同源体2(Src homology 2, SH2)结构域与受体结合，经过JAKs信号传递引起STATs的磷酸化，进一步形成STATs二聚体，进入核内与DNA启动子结合，启动靶基因转录。JAK-STAT通路参与了Th2细胞的分化，并且IL-4、IL-13与其受体IL-4Rα、IL-13Rα结合后，也可激活JAK-STAT通路。De Wilde等[24]发现，小鼠体内特异性敲除A20基因后，IRF4、STAT1的表达明显增加。Lee等[25]研究表明，小鼠体内过表达A20蛋白后，可以明显改善小鼠溃疡性结肠炎的炎症表现，并且过表达A20后，转录因子p-p65和p-STAT3的表达均明显减少。因此，A20可通过多种途径调控哮喘的发生。随着研究的进一步发展，A20更多的调控功能也将会被发现，其可能成为治疗过敏性哮喘的一个潜在新靶点。

4 小结

越来越多的结果显示，A20在过敏性哮喘中扮演着重要的作用，参与了多种过敏性疾病的发生、发展。目前普遍认为A20主要是NF-κB的一种负调控因子，在参与过敏性哮喘发生的支气管上皮细胞及免疫细胞(如Th2细胞、ILC2等)中的研究较为广泛，但其具体调控机制仍不清楚。体内特异性敲除A20后，能够加重过敏性哮喘发病症状，给予重组A20能够明显缓解炎症反应，这些反应主要是依赖于A20蛋白与RIP1、NEMO、TRAF6等特异性结合后，发挥泛素化和去泛素化双重功能，起到信号抑制作用。除此之外，也有最新研究发现，A20可以调控IRF4、STAT3、STAT6等转录因子的表达，以及NLRP3炎症小体的组装，但是具体方式仍不清楚，提示A20可能存在多种负调控机制，并且其可能是治疗哮喘的潜在靶点。过敏性哮喘发病机制复杂，其多复发性成为世界性的难题，因此，对A20进行基因解析、蛋白质结构分析及调控机制探讨，对于过敏性哮喘的预防和治疗具有重大意义。