UPLC-MS/MS同时测定保健食品中洛伐他汀及其类似物

韩 智龚 蕾王会霞朱晓玲王 彬曹 琦吴婉琴

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430070； 2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心 湖北 武汉 430070)

保健食品亦称功能性食品，具有调节人体功能的作用，但不以治疗疾病为目的，适于特定人群食用[1]。据报道[2]，2018年中国保健品的产值达到4 000亿元人民币。高血脂等心脑血管疾病成为严重危害中国人民健康的隐形杀手，降血脂类保健食品在保健食品中占有重要地位。总黄酮、茶多酚、总皂苷、总蒽醌、粗多糖是降脂保健食品的主要功能因子，而银杏叶、绞股蓝、山楂、荷叶、泽泻是使用频率最多的原料[3]。市面上的保健食品名称中常含有螺旋藻、大豆磷脂、鱼油、沙蒜、红曲等名词，带给消费者营养健康的感觉，受到目标人群的青睐。然而，一些不法分子通过在保健食品中非法添加化学药物，使其功效显著，从而达到获取高额利润的目的，此类非法添加物的含量往往具有随意性，甚至超过相应药品的推荐服用剂量，可能导致消费者发生轻微中毒，严重的甚至危及自身生命[4]。2018年5月，中国市场监督管理总局公布了2017年7月以来全国各地保健食品整治案件信息，非法经营行为占全部案件总数高达45.19%，其中又以非法添加药物为主[2]。他汀类药物是目前最有效的降血脂药物，是不法商家非法添加的首选。他汀类药物通过阻断羟甲戊酸代谢途径，促使细胞内的胆固醇合成变少，从而刺激细胞膜表面低密度脂蛋白受体活性增加，加速清除血清胆固醇，从而达到降低血脂和治疗动脉粥样硬化的目的[5-6]。

为保证降血脂类保健食品行业的良性发展，中国有关部门发布一系列保健食品监督抽检细则，降低保健食品的安全风险。2018版《国家食品安全监督抽检实施细则》[7]中明确将烟酸、洛伐他汀、辛伐他汀3种药物列为日常监督抽检项目，对应的检测方法为食药监办许[2010]114号[8]，定量方法为高效液相色谱法。2018年10月，中国食品保健食品欺诈和虚假宣传整治工作领导小组办公室发布《食品保健食品欺诈和虚假宣传整治》问答[9]，将美伐他汀、洛伐他汀羟酸钠盐、去羟基洛伐他汀作为辅助降血脂食品抽检风险监测项目，未公布具体检验方法。在文献报道中，他汀类化合物常用的检测方法有薄层色谱法[10]、高效液相色谱法[11]、气相色谱—质谱联用法(GC-MS/MS)[12]、液相色谱—质谱联用法[13-15]。这些检测方法涵盖洛伐他汀、辛伐他汀等常见的药物，但是对去羟基洛伐他汀及羟基洛伐他汀羟酸钠盐的研究较少。于泓等[16]、钮正睿等[17]采用超高效液相色谱—四级杆—飞行时间串联质谱(UPLC/Q-TOF-MS)测定保健食品中的去羟基洛伐他汀及羟基洛伐他汀羟酸钠盐，但使用LC-MS/MS的检测方法鲜有报道。相比于LC-TOF-MS而言，LC-MS/MS仪器价格相对廉价，方便快捷，许多实验室都有配备。因此开发一种同时检测洛伐他汀及其类似物的方法对促进保健食品行业健康发展，保障食品安全具有重要意义。

本试验拟以5种常见辅助降血脂药物为目标，采用UPLC-MS/MS，以多反应监测模式，建立定性、定量检测辅助降血脂保健食品中5 种降血脂药物的方法。并对17批市售的辅助降血脂功能保健食品进行检测，为降血脂类保健食品的安全风险监控提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀：规格为100 μg/mL，1 mL，美国First Standard公司；

去羟基洛伐他汀：纯度为98.0%，1 mg，美国First Standard公司；

洛伐他汀羟酸钠盐：纯度为95.2%，10 mg，美国First Standard公司；

甲醇、乙腈：HPLC级，美国Merck公司；

17种辅助降血脂保健食品：市售。

1.2 仪器与设备

液质联用仪：Waters TQD型，美国Waters公司；

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3型，50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司；

超纯水器：Milli-Q型，法国密理博公司；

孔径滤膜：0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司；

涡旋振荡器：Talboys型，上海安谱实验科技股份有限公司；

高速离心机：Avanti JXN-30型，美国Beckman Coulter公司；

电子天平：ME204型，梅特勒-托利多仪器有限公司；

数控超声波清洗器：S 180H型，德国Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 相关溶液的配制 分别精密量取800 μL浓度为100 μg/mL 的洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀于10 mL容量瓶，用甲醇稀释并定容至10 mL，配制浓度为8 μg/mL的单标溶液。用甲醇溶解1 mg去羟基洛伐他汀，并转移到10 mL 容量瓶，定容，配制浓度为100 μg/mL标准溶液；称取洛伐他汀羟酸钠盐4 mg，用甲醇溶解，并定容到10 mL，配制浓度为400 μg/mL标准溶液。标准工作液根据需要稀释。

1.3.2 样品前处理 参考《国食药监办许[2010]114号》[8]的前处理方法并加以改进。油状胶囊：刺破胶囊，将内容物挤出，混匀。口服溶液：取同一批次口服液混匀。固体颗剂：用研钵将片剂研磨成粉状，混匀。精密称取混匀的样品1.0 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇约40 mL，混匀，超声处理(功率800 W，频率 37 kHz)30 min，取出，放冷，用甲醇定容到刻度，取续滤液，过0.22 μm 滤膜，备用。

空白基质：精密称取空白样品适量，使用与样品同样的前处理方式，得到空白基质。

1.3.3 超高效液相色谱条件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)为固定相；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，洗脱梯度为：0.0～0.5 min，B相保持90%，0.5～1.5 min，B相 90%～5%，1.5～3.0 min，B相保持5%，3.0～3.1 min，B相5%～90%，3.1～5.0 min，B相90%。柱温35 ℃；进样量5 μL；流速0.3 mL/min。

1.3.4 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正负离子同时扫描；毛细管电压：3 000(ESI+)，-2 500 V(ESI-)；源温度：150 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；锥孔气流量：50 L/h；采集模式：多反应监测(MRM)。各化合物的质谱参数见表1。

表1 5种化合物的质谱参数†

† *. 定量离子。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

采用蠕动泵分别将浓度为 1 μg/mL的5种标准品注入离子源，在全扫描模式下分别对5种化合物进行一级质谱分析，发现洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、去羟基洛伐他汀采用正离子扫描模式响应高，洛伐他汀羟酸钠盐采用正负离子扫描响应均高，但后续试验发现采用负离子扫描干扰小，故采用负离子扫描。分别对分子离子进行二级质谱分析，选取丰度强且干扰少的2对子离子，通过优化锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，使相应离子响应达到最大值，得出最佳质谱条件，见表1。

2.2 液相条件优化

流动相的组成会影响色谱峰形、分离度及灵敏度。LC-MS/MS分析中正离子模式通过添加甲酸，负离子通过添加氨水或易挥发缓冲盐来提高离子化效率，通过改变流动相洗脱梯度来分离化合物。本试验考察了水+乙腈、0.1% 甲酸水溶液+乙腈、水+甲醇、0.1%甲酸水+甲醇作为流动相时，5种目标化合物离子对的响应强度及色谱峰形。结果表明以0.1%甲酸水溶液+乙腈作为流动相时，5种化合物的响应最高，峰形尖锐且对称。还考察了流速为0.2，0.3，0.4 mL/min时的色谱图，发现0.4 mL/min时峰形最尖锐，但系统压力高，且灵敏度低于0.3 mL/min条件下的灵敏度，因此本试验采用0.3 mL/min流速。5种化合物的总离子流图见图1。

2.3 基质效应

UPLC-MS/MS是定性定量检测保健食品中非法添加药物的常用检测方式，但这种检测方式可能有基质效应，造成检测方法不稳定，结果不准确。在实际检测中，当基质效应为80%～120%时可忽略。本试验研究了3种不同类型的降血脂保健食品(油状胶囊、口服溶液、固体颗粒)的基质效应。试验结果表明，5种化合物在3种不同基质中的基质效应均为80%～120%，基质效应可以忽略。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限及定量限 配制一系列质量浓度的标准溶液在1.3的条件下进行测定，以响应为纵坐标，化合物质量浓度为横坐标，绘制线性方程，得出5种物质在一定线性范围内呈现出良好的线性关系，相关系数均>0.99，以3倍信噪比确定目标化合物的检出限，10倍信噪比确定目标物的定量限，结果见表2。

图1 5种化合物的总离子流图

表2 5种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

表3 5种化合物的加标回收率及相对标准偏差

2.4.2 方法的回收率及精密度 按0.05，0.50，1.00 mg/kg 3个质量浓度水平对空白样品进行添加回收试验，每个添加水平平行测定6次，按照本方法进行检测，计算平均回收率及标准偏差。结果(表3)显示，5种化合物平均回收率为 94.6%～105.7%，相对标准偏差均<10%，该方法的回收率和相对标准偏差均具有较好的准确度和精密度，满足分析要求。

2.5 实际样品检测结果

本试验共检测辅助降血脂类保健食品17批次。结果发现某品牌大豆磷脂胶囊检出洛伐他汀、洛伐他汀羟酸钠盐、去羟基洛伐他汀，其含量分别为1 800.00，11.13，0.12 mg/kg。

3 结论

本试验用UPLC-MS/MS同时测定保健食品中5种洛伐他汀及其类似物，方法简便、快速，系统的方法学评价结果表明该方法操作简便、回收率好、灵敏度高、定量准确，能满足降血脂类保健食品中洛伐他汀及其类似物的测定要求。但本试验没有对临床上常用的其它他汀类物质同时检测，今后可以进一步对保健食品中风险较大的他汀类物质进行UPLC-MS/MS检测。