致水貂肺炎的铜绿假单胞菌分离鉴定及药敏试验

靖吉强 武世珍 郭洪梅 （山东畜牧兽医职业学院 潍坊 261061 ） 陈国花 谭清华 （山东省诸城市畜牧兽医管理局）



致水貂肺炎的铜绿假单胞菌分离鉴定及药敏试验

靖吉强 武世珍 郭洪梅*（山东畜牧兽医职业学院 潍坊 261061 ） 陈国花 谭清华 （山东省诸城市畜牧兽医管理局）

本文对致水貂肺炎的病源菌进行了分离鉴定及药敏试验，结果表明，致水貂肺炎的病菌为铜绿假单胞菌；药敏试验结果为美罗培南和头孢他啶为高度敏感药物。

水貂 肺炎 铜绿假单胞菌 鉴定 药敏试验

潍坊水貂养殖比较普遍，正处于品种不断更新、产业不断发展的过程中。但每年的8~9月份，水貂肺炎在不少水貂养殖场频繁发生，发病率有时高达60%~80%，致死率高。2018年9月，潍坊一水貂养殖场发生传染性肺炎，现把病情诊断及病原分离鉴定情况汇报如下：

1 材料与方法

1.1 材料

发病水貂，来自潍坊某水貂养殖场。沙氏葡萄糖琼脂培养基、Baird-parker培养基、营养琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基均购自北京路桥技术股份有限公司。沙门氏菌显色培养基、血液琼脂培养基均购自潍坊天衡医疗器械有限公司。药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂饲养管理和发病情况调查 发生肺炎的水貂场，饲养水貂2000只。平时饲喂鱼排、鸡架、毛蛋、花生粕、玉米面以及含多种微量元素和维生素的预混剂等构成的混合饲料。鱼排、鸡架、毛蛋等饲料蒸熟、搅碎后成糊状饲喂，自由饮水。幼貂断奶后免疫犬瘟热活疫苗，初免1个月后加强免疫一次。在7月初对非种用幼龄水貂埋植褪黑激素。2018年9月，水貂陆续发病，病貂有的呼吸困难，口鼻出血，急性死亡。有的发育迟缓，不愿运动，逐渐消瘦。发病期间投喂复方新诺明、氨苄西林，效果不明显。发病后1周，共死亡当年幼貂89只，未埋植褪黑激素的幼龄种貂发病很少。

1.2.2 病理变化检查 剖检刚死亡的水貂2只，可见肺部肿胀，严重出血、淤血。心、脾、肝和肾未见明显病变。胃、肠内容物空虚。

1.2.3 犬瘟热检查 按照林特睿检TM犬瘟热抗原快速诊断试纸的说明书进行操作，取2只病貂眼、鼻、口的分泌物，和试剂盒的缓冲液混匀，然后取4滴缓冲液加入试纸卡的加样窗中，5~10min内读取结果。

1.2.4 触片、染色、镜检 常规无菌操作采集2只病貂的肺脏，作触片。然后用美兰染色液染色、显微镜油镜检查。

1.2.5 细菌的分离培养 常规无菌操作采集2只病貂肺脏，分别接种沙门氏菌显色培养基、血液琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、Baird-parker培养基、营养琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基。37℃培养24h，观察结果。

1.2.6 16S rRNA基因序列测定与比对 （1）分离菌基因组DNA提取：取血液琼脂培养基上生长出的具有完全溶血性的小菌落，接种营养肉汤培养基，37℃培养24h，获得纯培养物。用该纯培养物提取该细菌的总DNA。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的介绍的操作步骤提取细菌DNA。提取的总DNA用于分离菌的PCR检测。（2）分离菌16S rRNA基因PCR检测及测序：引物采用细菌16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'；1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，设计扩增片段为1514bp。PCR反应体系为：DNA模板1µl，2×Master Mix 20µl，上、下游引物个1µl，加超纯水至反应体积为40µl，震荡混匀后，1000转离心1min后放入PCR仪。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min。反应结束，温度降至4℃，直至取出。取5µl PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳。若有预计大小的核酸片段出现，则将剩余的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。将测得的PCR产物序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中，用BLAST程序在线进行基因序列相似性比对，搜索与PCR产物序列相同或相似的基因序列。

1.2.7 分离菌的生化试验 将分离菌的纯培养物用革兰氏阴性菌鉴定卡(梅里埃VITEK 2GN 21341)进行生化鉴定。严格按该产品说明书介绍的操作步骤在全自动微生物鉴定及药敏分析系统(型号：VITEK 2 compact system)上进行生化试验。

1.2.8 分离菌的药物敏感性试验 无菌操作将分离菌的纯培养物均匀涂布到营养琼脂培养基上，然后贴药敏片。37℃培养18~24h。观察并记录结果。根据美国国家标准化委员会(NCCLS)/美国临床实验室标准化研究所(CLSI)药敏试验执行标准进行药物敏感性的判断。

3 结果

3.1 镜检及分离培养的结果

2只病貂肺脏触片，染色后镜检，均发现的散在排列的小杆菌。2只病貂的肺脏分别接种沙门氏菌显色培养基、血液琼脂培养基等6种培养基。37℃培养24h后观察结果，发现：Baird-parker培养基未见任何细菌生长；营养琼脂培养基有很多中等大菌落生长，菌落周围培养基被染成蓝绿色；血液琼脂培养基上生长出大小一致、表面光滑、有β溶血的小菌落；结晶紫中性红胆盐琼脂培养基生长有很多非红色菌落；沙门氏菌显色培养基有很多微红菌落生长；沙氏葡萄糖琼脂培养基有很多白绿色小菌落生长。

3.2 犬瘟热检查的结果

2只病貂犬瘟热检查结果：对照线©均显色，而检测线(T)均不显色。因此病貂未患犬瘟热。

3.3 16S rRNA基因序列测定与比对

通过对分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约1500bp的核酸片段。将分离菌的16SrRNA基因的序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中，用BLAST程序在线进行基因序列相似性比对，发现该分离菌与登录号为 KR349493.1的序列同源性为99%，因此确定该菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

3.4 分离菌的生化结果

分离菌的生化试验结果见表1。该生化结果以98%的概率和极好的鉴定置信度鉴定该菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。

表1 分离菌的生化试验结果

3.5 药物敏感性

头孢他啶、美罗培南敏感。阿莫西林、头孢呋辛、四环素、庆大霉素和恩诺沙星等不敏感。具体见表2。

表2 药敏试验结果

注：R为耐药，S为敏感，I为中介

4 讨论

（1）铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)在自然界分布广泛，可存在于水、土壤和空气中，是一种常见的条件性致病菌，革兰氏染色后呈红色[1]。它可感染狐狸、水貂、鸡、犬、牛等多种动物，导致被感染动物乳房炎、流产、阴道炎、子宫内膜炎、肺炎、败血症等[2]。这次从发生肺炎的水貂肺脏中只分离到铜绿假单胞菌，未检测到犬瘟热病毒。说明铜绿假单胞菌是导致本次水貂肺炎的致病菌。（2）铜绿假单胞菌可感染不同品种、不同日龄的水貂，可经污染的空气经呼吸道感染，也可经伤口感染，造成局部化脓，甚至败血症。死亡率可达30%~60%。本次水貂肺炎疫情发生后，先后波及相邻的2个水貂养殖场，造成较大经济损失。因此，加强饲养管理，定期清粪，严格消毒饲养场所，经常灭蝇除蚊，执行严格的生物安全措施可减少本病的发生。（3）对于经常发生铜绿假单胞菌感染，造成肺炎的水貂场。可分离铜绿假单胞菌，做成自家苗，在每年的7月初可免疫一次，幼龄水貂个半个月后可强化免疫一次，增加免疫效果。通过免疫接种，降低水貂对该病的易感性，从而减少该病的发生[3]。（4）水貂养殖场应注意厂址的选择。建场时应远离村庄和其他毛皮动物饲养场，以利于防疫。每年的8~9月份，可使用风机湿帘等降温设施，使水貂生活在温度适宜的环境里，避免热应激导致水貂抗病力下降，减少铜绿假单胞菌导致的水貂肺炎。（5）本次从水貂肺部分离到的铜绿假单胞菌，对头孢呋辛、四环素、庆大霉素等多种抗菌药不敏感，只对美罗培南等少数抗菌药敏感。为减少铜绿假单胞菌的耐药性，应提升养殖模式，创造更好的养殖环境，采用优质饲料，提高水貂抗病力，减少抗菌药物在水貂养殖过程的使用。

[1] 朱利霞, 王洪彬, 杨楠等. 水貂绿脓杆菌病研究概述[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2018(18): 214-217.

[2] 竹堃园, 吴兰, 刘燕霏等.犬子宫蓄脓中绿脓杆菌分离鉴定及耐药性分析[J].天津农学院学报, 2018, (3): 47-51.

[3] 庄金秋, 梅建国, 沈志强等.水貂出血性肺炎的实验室诊断方法研究进展[J].经济动物学报, 2013, 17(4): 225-227.

潍坊市科技发展计划项目，项目编号2014GX069，项目名称：山东部分地区毛皮动物肺炎流行病学调查及防治技术研究

（2019–01–10）

S852.61

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1007-1733(2019)04-0009-02