A型流感病毒感染雪貂造模的研究进展

马树杰，张博，孔宇飞，关云涛

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室， 哈尔滨 150069)

流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属，它是单股负链具有囊膜的RNA病毒。根据核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白(matrix，M)的不同，流感病毒可以分为A、B和C三种亚型。其中A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是一种重要的人兽共患传染病病原，可以引起人和多种动物感染发病，对公共卫生安全具有巨大威胁。IAV根据血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，又可以分为不同的亚型。目前HA可以分为18个亚型，NA可以分为11个亚型，其中H1-H16和N1-N9亚型病毒均已在水禽体内发现，而 H17N10 和 H18N11 的自然宿主是蝙蝠。IAV的基因组分为8个节段，编码多达17种蛋白，其中必需蛋白有10种PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2，非必需蛋白主要包括PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3[1-6]。其中PB2、PB1、PA、NP和病毒的vRNA组装成核糖核蛋白复合体(viral ribonucleoprotein, vRNP)，vRNP负责病毒的转录和复制—是IAV增殖的核心功能单位。HA和NA蛋白是IAV的两种表面糖蛋白，HA结合细胞表面的唾液酸受体，并介导病毒囊膜与内吞体膜的融合，促进病毒的入侵。NA的神经氨酸酶活性可以切割宿主细胞和病毒表面与糖蛋白连接的唾液酸，促进子代病毒粒子释放，阻止新生病毒粒子在细胞表面的聚集。此外，M2是病毒粒子的另一囊膜蛋白，它的质子通道活性激活后，导致病毒粒子内部酸化，促进病毒的脱衣壳。

历史上曾发生过4次较大的流感大流行，分别为 1918 年西班牙流感(H1N1)，1957年亚洲流感(H2N2)，1968年香港流感(H3N2)和2009年的甲型流感(H1N1)。1918年的西班牙流感大流行损失惨重，至少造成 2000万人死亡。IAV变异频繁，当人体内缺乏中和抗体时，病毒感染人发病，严重的甚至导致死亡，比如H7N9亚型、H10N8亚型感染人致死事件[7-8]。新出现的IAV不仅严重危害了畜禽养殖业，而且对公共卫生安全具有巨大的潜在威胁。据WHO统计，H7N9 IAV自2013年爆发以来，目前已经造成1567例人感染，其中死亡615人，致死率高达39.2%[9]。2017年初，H7N9 IAV的HA碱性裂解位点插入了4个氨基酸，变成了对鸡呈高致病性的H7N9 IAV[10]，造成养殖场大批鸡死亡，同时2017年冬季 H7N9感染人病例激增，对公共卫生安全持续造成威胁。

IAV持续进化，新的亚型不断出现，流感大流行随时可能爆发，因此IAV的研究一直是病毒学领域研究的热门。选择合适的动物模型研究IAV致病性和传播特性可以为病毒防控提供策略，进而为疫苗的研制提供指导方针。雪貂(Mustelaputoriusfuro)是哺乳动物，属于鼬科，貂属。雪貂缺乏盲肠，但有对称的鼬科分泌麝香的肛门腺，这对腺体是潜在的防御器官，目前实验用的大部分雪貂均通过外科手术摘除了肛门腺。雪貂饲养的适宜温度是18 ～ 22℃，湿度是40% ～ 60%，温度高于30℃，成年貂就表现出紧张不安，有热虚脱的可能，因此雪貂饲养室的空气对流和温度均应保持在适宜水平。IAV研究中应用的雪貂需进行常见亚型如H1、H3、H5、H7和H9等流感病毒抗体的检测，以确定实验中使用的雪貂流感病毒抗体阴性。雪貂是研究IAV较为常用的感染模型，在IAV的致病性、传播能力和疫苗研发方面发挥着重要作用。

1 雪貂模型概述

在IAV研究中，选择合适的动物模型有利于科学地阐释实验结果，得出科学的结论。目前IAV研究中，应用较普遍的动物模型有小鼠、豚鼠、雪貂和非人灵长类动物[11-13]。不同的动物模型具有各自的优点和限制性(表1)，在选择动物模型时需要综合考虑。通过表1可以发现，四种动物模型具有不同的宿主特性和IAV研究的应用范围。雪貂与非人灵长类动物二者具有相似的受体分布，感染IAV后表现相似的临床症状，均是IAV研究中较为理想的研究模型。但是考虑到动物的获得难易和饲养成本，雪貂模型比非人灵长类动物模型更具优势，此外在感染IAV后表现的临床症状方面，雪貂比小鼠和豚鼠更具优势(表1)，且雪貂对H1、H3、H5、H7及H9等多种亚型的IAV均易感[14]，因此雪貂是IAV研究中较为常用的动物模型。

利用雪貂模型研究IAV具有许多优点：雪貂对IAV易感，病毒未经适应即可感染；雪貂上呼吸道和下呼吸道α2,6-SA(人源受体)和α2,3-SA(禽源受体)分布与人类似，可以有效模拟病毒自然状态下IAV的感染和传播[15](表1)，因此雪貂模型评估IAV的传播能力应用广泛；雪貂感染IAV后临床症状与人发病相似，IAV致病性评估时雪貂常表现为发热、厌食、体重减轻、打喷嚏、鼻腔分泌物增多、嗜睡[16-17]症状(表1)；雪貂体型较小，易于饲养，实验操作简便。雪貂模型不足之处主要有：缺乏近交系(inbred)；价格昂贵，有些实验室很难承担巨大的经济费用[18]。但是综合评估，雪貂作为动物模型优点大于缺点，因此雪貂模型在IAV的致病性、跨宿主传播以及评估疫苗保护效力等方面应用十分广泛。同时雪貂基因组草图的绘制完毕，为雪貂模型的广泛应用奠定了坚实的基础[19]。

表1 雪貂与小鼠、豚鼠和非人灵长类动物模型在IAV研究中的比较Table 1 Comparisons of ferret models with mouse, guinea pig and non-human primate models in IAV research

2 雪貂模型在IAV致病性上的应用

不同亚型的IAV对哺乳动物的致病性不同，临床表现从不发病到死亡不等。雪貂感染H1、H3、H6、H9后，尽管病毒可以在多个脏器内高效复制，但是雪貂发病温和，临床症状轻微，往往呈现一过性发病[20-22]。雪貂感染高致病性H5亚型禽流感病毒后，往往出现典型的流感症状，严重的出现神经系统症状，并最终导致雪貂死亡[14, 23]。Peng等[23]将一株人源H5N1流感病毒分离株A/Vietnam/1203/04(H5N1)感染雪貂，观测期内雪貂出现严重的中枢神经系统症状，呈现癫痫、斜颈以及瘫痪的姿势。病理学研究发现病毒主要感染神经元细胞，而室管膜细胞和星形胶质细胞也有零星感染，病理学变化表现为脑膜炎和脑炎。这表明高致病性H5N1流感病毒可以在雪貂中枢神经系统内高效增殖，这可能是诱发雪貂死亡的一个重要因素。人感染高致病性H5N1流感病毒的致死案例中，尸检发现脑也出现严重的损伤。高致病性H5N1流感病毒除了会诱发严重肺损伤之外，中枢神经系统的损伤也是导致死亡的重要因素。Herfst等[24]系统研究了一株人源H5N6高致病性流感分离株(GZ/14)，该株病毒PB2蛋白627位点为赖氨酸(lysine, K)，具有很高的聚合酶活性。给雪貂鼻腔接种该病毒，接种后第3天雪貂活动性下降，被毛凌乱，眼角湿润，平均体重下降13%，出现明显的流感感染症状。病毒可以在肺、鼻甲和扁桃体等多器官复制。气管内接种，雪貂出现重症肺炎，接种后第2天即出现死亡。但是并非所有高致病性H5亚型流感病毒接种雪貂都出现严重流感症状。Noh等[25]将一株2.3.4.4分支的高致病性H5N6流感病毒(Md/Kr/2016)滴鼻感染雪貂，尽管可以在雪貂的鼻甲、肺和脑中低滴度复制，但雪貂没有出现明显的临床症状，体重也未下降。与GZ/14株相比，Md/Kr/2016株病毒缺乏哺乳动物适应毒株的分子特征，这可能是其对雪貂呈现低致病性的重要原因。Pulit-Penaloza等[26]将H5N2和H5N8感染小鼠和雪貂，虽然两株病毒均能引起小鼠严重发病，但是雪貂并未表现明显临床症状，无多器官感染。

IAV感染哺乳动物或人后，在宿主体内增殖，容易获得适应哺乳动物的基因突变，突变后的病毒对哺乳动物的致病性增强[10, 22]。Li等[22]将H9N2病毒以106EID50剂量接种雪貂，第二天采集的鼻洗液测序，就发现PB2蛋白出现了E627 K或D701 N的突变，突变后的病毒对哺乳动物的致病性大大增强。2013年，中国爆发新型低致病性H7N9流感疫情，引起多人的死亡。研究表明雪貂感染H7N9流感病毒后临床症状表现并不明显，但是病毒可以在肺脏、鼻甲、气管、扁桃体以及脑内增殖，病理学检测发现雪貂出现严重的支气管肺炎[27-28]。2017年初，低致病性H7N9流感病毒HA碱性裂解位点处插入了四个氨基酸，突变成了高致病H7N9流感病毒。不同来源的高致病H7N9流感病毒感染雪貂后，呈现出不同的的致病性[10, 29]。Shi等[10]选取CK/SD008株高致病性H7N9禽流感病毒感染雪貂，虽然病毒可以在雪貂的鼻甲、扁桃体、肺和脑内复制，但是雪貂临床症状并不明显。然而雪貂感染病毒后的第4天，剖杀取脏器后分离病毒测序，发现扁桃体、鼻甲和肺均检测到了PB2 E627 K或D701 N的突变病毒株。将突变病毒株CK/SD008-PB2/627 K和CK/SD008-PB2/701 N突变病毒再次滴鼻感染雪貂，雪貂发病严重，分别于感染后第8天和第10天各死亡一只。Imai等[29]评估了一株人源高致病性H7N9分离株(GD/3)以及其NA突变株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K，这三株病毒感染雪貂后均出现严重的食欲下降，昏睡临床症状。病毒均可以在鼻甲、气管、肺、脑中复制，GD/3可以在肾和小肠中复制。组织病理学检查发现肺出现严重的组织损伤。感染GD/3，rGD/3-NA294R和rGD/3-NA294 K的雪貂分别于第8天，第4和第8天以及第6天各死亡1只，2只和1只。有趣的是，这些病毒并不具有经典的适应哺乳动物的分子标记PB2 627 K或701 N。PB2 588位点丙氨酸(alanine, A)到缬氨酸(valine, V)的突变可以增强病毒对哺乳动物的致病性[30]。GD/3及其NA突变株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K的PB2 588位均为V，而CK/SD008、CK/SD008-PB2/627 K和CK/SD008-PB2/701 N的PB2 588位均为A，这可能在一定程度上解释了GD/3及其NA突变株为什么对雪貂呈现高致病性。GD/3分离于一名使用达菲且致死的患者，其PB2 A588 V的突变很有可能是病毒在患者体内复制是获得的。禽流感病毒在哺乳动物体内复制时获得适应性的突变，对哺乳动物的致病性大大增强。统计数据表明，H7N9流感病毒感染人的毒株中，有83%的病毒株其PB2位点具有627 K或701N[10]。这些研究表明，虽然HA碱性裂解位点处含有多个碱性氨基酸是H5和H7高致病性流感病毒的分子特征，但是HA仅含有多个碱性氨基酸并不能一定对哺乳动物呈现高致病性，还需要多个其他基因的影响，比如PB2 588、627和701位点。利用雪貂模型，研究人员揭示了这些位点对哺乳动物致病性的影响，通过监测IAV的这些氨基酸位点，可以为IAV致病性的评估和防控提供参考。

3 雪貂模型在IAV传播上的应用

流感病毒的传播主要有三种形式，即接触传播、飞沫传播和空气传播。接触传播主要是指易感宿主直接或间接地接触到传染源的感染性分泌物，导致易感宿主发病；飞沫传播是指传染源咳嗽、打喷嚏或说话喷射出直径大于5 μm的小液滴，这些小液滴被易感宿主吸入到呼吸道黏膜，引起易感宿主发病；空气传播是指直径小于5 μm的干燥气溶胶，在空气中做布朗运动，可长距离传播，一旦被易感宿主吸入到呼吸道，即引发感染。一般利用雪貂模型研究IAV的接触传播和飞沫传播能力，尤其是研究飞沫传播能力应用最广泛，以此来评估季节性流感和禽流感病毒的人际间流行的风险[31-32]。

IAV由结合α2,3-SA(禽源受体)受体向结合α2,6-SA(人源受体)受体的转换通常被认为是IAV获得人与人之间传播能力并引发流感大流行的必要条件[15]。禽流感病毒主要结合α2,3-SA(禽源受体)受体，而人流感病毒主要结合α2,6-SA(人源受体)受体，雪貂的上呼吸道黏膜表达有大量α2,6-SA(人源受体)受体，这与人上呼吸道类似，而α2,3-SA(禽源受体)受体则主要在下呼吸道表达，因此HA的受体结合特性在一定程度上决定了IAV能否在雪貂间飞沫传播。不同宿主IAV HA受体结合区域(receptor binding site，RBS)的氨基酸残基都很保守，而不同亚型IAV的受体结合特性又各不相同，即便是相同亚型，不同宿主来源也存在差异[33]。Tumpey等[34]将1918 H1N1流感病毒株SC18的HA上引入D190E和D225G两个氨基酸突变后，病毒由结合α2,6-SA受体转变为结合α2,3-SA受体，雪貂飞沫传播由3传3变为3传0，仅HA蛋白上两个氨基酸的突变即可以使病毒在雪貂上由高效飞沫传播变为不传播，由此可见HA受体结合特性在飞沫传播中的重要性。2013年中国出现的低致病性H7N9流感病毒(LPAIV H7N9)可以同时结合人源受体和禽源受体[27]，分析这些病毒的HA，发现186缬氨酸(V)和226位亮氨酸(L)是导致LPAI H7N9具备结合人源受体的关键氨基酸[35]。LPAIV H7N9在雪貂上的传播能力具有毒株特异性，不同毒株在雪貂上飞沫传播的效率也不相同[27, 36-37]。

流感病毒PB2上的E627 K和D701 N的突变也能够促进病毒在雪貂间的飞沫传播。Shi等[10]将分离到的高致病性H7N9流感病毒CK/SD008接种雪貂，仅在一只传播组雪貂鼻洗液中分离到了低滴度病毒，传播能力较低；而当接种CK/SD008-PB2/627 K毒株时，三只传播组雪貂均分离到了病毒，高效飞沫传播；而接种CK/SD008-PB2/701 N毒株时，两只传播组雪貂可以分离到病毒，另一只雪貂血清转阳，表明三只雪貂也均发生飞沫传播。Imai等[29]评估了一株人源高致病性H7N9分离株(GD/3)以及其NA突变株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K在雪貂上的飞沫传播能力，三株病毒均可以在雪貂间飞沫传播。这三株病毒均不含PB2 627 K和701 N，但是588位点为V，有研究表明PB2 588 V是哺乳动物适应性氨基酸[30]，但是该位点是否是导致这三株病毒发生飞沫传播的主导因素仍需进一步的实验研究。

IAV能否发生飞沫传播，是由病毒、宿主和环境多因素决定的。低温和干燥可以促进IAV的飞沫传播能力[38]，而飞沫液滴大小也对飞沫传播具有影响。通过设计不同的实验，控制实验变量，可以利用雪貂模型评估不同因素对飞沫传播的影响。雪貂评估IAV的传播能力可以有效预测IAV在人际间的传播潜力[32]，从而为流感大流行提供预警，为制订防控措施提供参考。

4 雪貂模型在IAV疫苗评估方面的应用

疫苗在IAV的防控中发挥着重要的作用[39-40]，而选择合适的动物模型来评估疫苗的安全性和免疫原性对于疫苗的研发至关重要。由于雪貂模型在IAV研究中的优异表现，因此利用雪貂模型来评估流感疫苗的免疫保护效力在疫苗研究中应该十分广泛。

Kong等[41]构建了一株冷适应性弱毒活疫苗H7N9/AAca，该疫苗免疫雪貂后血凝抑制效价和中和效价均较高，一次免疫就可以阻止病毒在雪貂下呼吸道复制，二次免疫可以完全阻止病毒在雪貂体内复制，而一次免疫就可以阻止病毒的呼吸道飞沫传播。Chen等[42]构建的H7N9ca疫苗株在雪貂上有良好的免疫原性，单次免疫就可以保护野生型病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)和异源A/Netherlands/219/2003 (H7N7)的攻毒感染。Hatta 等[43]构建了一株H7N9灭活疫苗株HK125-HYPR8，肌肉注射免疫雪貂，攻毒保护实验表明该疫苗可以阻止病毒在雪貂下呼吸道复制，并能使上呼吸道的病毒较快清除，而对照组雪貂因出现严重的呼吸道症状死亡。Wang等[44]利用转座子诱变系统向M2基因插入了6个氨基酸，构建了一株减毒活疫苗W7-791，该疫苗免疫小鼠和雪貂后，可以对H1N1、H3N2和H5N1的攻毒提供完全保护。Rudenko等[45]评估了一株LPAI H7N9和一株HPAIV H7N9疫苗，疫苗免疫雪貂后不表现临床症状，病毒学和病理学数据表明疫苗对雪貂安全性良好，一次免疫即可刺激机体产生较好的免疫原性。这些研究表明，无论是减毒活疫苗还是灭活疫苗，均可以用雪貂模型来评估其安全性和免疫原性，进而为疫苗在志愿者身上的应用提供参考，为疫苗研发提供了良好的保障。

5 结语与展望

一直以来IAV引起的流感都是对人类健康和养殖业具有严重威胁的人兽共患病。病毒持续进化，不断有新的IAV亚型感染人病例的报道[7, 46-47]，严重威胁着人类的健康。同时高致病性H5亚型流感病毒和高致病性H7亚型流感病毒在鸡群中的爆发，对社会造成了巨大的经济损失。H9亚型流感病毒感染人病例只有零星报道[48-49]，但是H9亚型流感病毒在家禽中广泛流行，它可以为其他亚型IAV的重组提供内部基因[50-51]，这使得其危害性不容小觑。雪貂模型由于其对不同亚型的IAV易感性强，感染IAV后表现出与人相似的临床症状，呼吸道受体分布与人类似等诸多优点，在IAV研究中广泛应用。IAV在哺乳动物体内复制时基因会发生适应性突变，利用雪貂模型评估病毒的基因突变能力和致病性，可以为病毒在人上的致病性提供预警。IAV在人际间的传播能力受病毒、宿主和环境多种因素的影响，利用雪貂模型评估IAV的呼吸道飞沫传播能力，为IAV可能发生的人际间传播提供了参考。雪貂接种IAV疫苗后，产生高滴度抗体，快速清除病毒，有效保护机体。同时疫苗可以阻断病毒在免疫后雪貂上的飞沫传播能力。这些研究都为我们深入认识和防控IAV提供了依据，为预防流感大流行提供了坚实的保障。雪貂模型在IAV的研究中广泛应用，但是基于雪貂模型的基础研究仍进展缓慢。目前，雪貂全基因组的测定为进一步开展宿主方面的研究提供了保障，但是针对雪貂免疫因子的检测试剂及相关抗体仍很难获得，一定程度上限制了雪貂在研究IAV方面的应用。由此可见，雪貂模型距离像小鼠模型一样成熟仍有很长的一段路要走。