二苯乙烯苷抑制NADPH氧化酶对小鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

薛威，唐虹，孙雨倩，江勤，黄大可，董六一*

(1. 安徽医科大学药理学教研室 抗炎免疫药理学教育部重点实验室 国家中医药管理局中药药理三级实验室； 2. 安徽医科大学临床医学院； 3. 安徽医科大学基础医学院，合肥 230032)

脑卒中是具有高发病率和死亡率的神经系统疾病之一，严重威胁人类健康，80%的脑卒中是缺血性的[1-2]。脑缺血后，再灌注会进一步加重脑组织损伤，据报道，缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤的一个关键机制是氧化应激[3-4]。氧化应激的主要原因是ROS的积累，过度的ROS诱导细胞膜和线粒体膜的损伤，以及DNA的降解，最终促使细胞凋亡[5]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)是脑I/R损伤中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要来源。中枢神经系统表达的NOX有 NOX1、NOX2、NOX4，而NOX4在脑I/R损伤中扮演着最为重要的角色[6]。参与氧化应激的主要ROS包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基，而NOX4主要产生过氧化氢[7]。因此，降低NOX4的水平对于脑I/R损伤具有很大的治疗意义。

二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside，TSG)是中药何首乌中特有的具有显著药理活性的水溶性有效成分，研究表明其具有抑制粥样硬化、防治老年性痴呆、抗肿瘤、保护脑组织等多种功能[8-10]。吴晓玲等[11]研究发现：TSG可以提高大鼠体内SOD含量和降低MDA含量减轻脑组织氧化应激损伤。梅劲春等[12]发现：用TSG治疗大鼠糖尿病肾病后，氧化应激指标ROS及MDA水平降低，SOD水平升高，肾间质纤维化减轻。这些研究结果提示，TSG可清除氧自由基，可有效对抗氧化应激损伤，具体的作用机制有待进一步阐明。本研究主要探讨TSG是否通过抑制NOX4的活性从而减轻小鼠脑I/R后的氧化应激损伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

5周龄SPF级雄性KM小鼠，体重22 ～ 24 g，购于安徽医科大学省级实验动物中心【SCXK(皖)2011-002】，饲养与实验均在安徽医科大学实验动物中心屏障环境中进行【SYXK(皖)2011-007】，并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。温度范围22 ± 3℃，湿度范围：40% ～ 70%，照明周期：12 h明/12 h暗，自由摄水进食。

1.1.2 药品与试剂

二苯乙烯苷(纯度：98%，批号：20170502，南京道斯夫生物科技有限公司，中国)，水合氯醛(批号：T20150610，国药集团化学试剂有限公司，中国)，0.9%氯化钠注射液(批号：170705074，上海华源制药股份有限公司，中国)，RIPA蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，中国)，PMSF(Sigma公司，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中国)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology，中国)，预染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，兔来源NOX4一抗、兔来源cleaved caspase-3/9 一抗、内参β-actin(CST公司，美国)，辣根酶标记山羊抗小鼠lgG二抗和山羊抗兔lgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)，SuperSignal West Femto高灵敏度发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，美国)。

1.1.3 仪器设备

超低温冰箱(Sanyo Electric CO. Ltd，日本)，TGL-16H高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司产品，中国)，DIAX-900内切式组织匀浆机(Heidolph公司，德国)，TE300 型倒置显微镜(Nikon 公司，日本)，SpectraMax190酶标仪(Molecular Devices，USA)，石蜡切片机(Leica，德国)，WD-9405B水平摇床(北京市六一仪器厂，中国)，Bioshine ChemiQ4600荧光及化学发光成像系统(上海欧翔科学仪器公司，中国)，JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波谱仪(日本电子，日本)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性脑缺血再灌注损伤模型建立

将100只实验小鼠随机分成5组：假手术组、模型组、二苯乙烯苷剂量组(3、6、12 mg/kg)，每组20只，给药体积为0.01 mL/g。适应性喂养5 d后，进行手术造模。所有小鼠术前禁食不禁水12 h。小鼠放入麻醉箱中给予1.33%(一个肺泡浓度)的异氟烷麻醉15 min后固定，分离双侧颈总动脉，并穿以6号线。在结扎之前将给药组小鼠通过尾静脉注射TSG一次，随即结扎双侧颈总动脉30 min后再经尾静脉注射给药一次，结扎2 h后，松开丝线进行再灌，24 h后处死小鼠。假手术组仅做颈动脉分离，不做结扎处理，且假手术组和模型组仅给予等量的生理盐水。

1.2.2 病理组织学检查

小鼠脑缺血再灌注后，处死取脑，每组取4个小鼠脑组织置于4%多聚甲醛中固定。经石蜡包埋制成切片，进行苏木精-伊红(HE)染色，BX-51型正置显微镜观察小鼠脑组织病理变化。

1.2.3 脑组织氧自由基检测

小鼠造模成功后，颈椎脱臼处死，取出大脑(去除小脑和脑干，每组8个小鼠大脑)，迅速将缺血区脑组织装入内径2 mm的薄壁聚乙烯塑料管中，并迅速放入液氮中待测。将JES-FA20000 spectrometer(JEOL)型ESR波谱仪谐振腔温度调整到130 K，从液氮中取出脑组织标本迅速放入ESR谐振腔内，测试ESR波谱，利用专用软件分析氧自由基信号情况。

1.2.4 DHE染色法检测脑组织中ROS水平

实验开始前，将-20℃保存的染色液(reagent B)放入冰槽里融化，稀释液(reagent C)置于室温预热。移出10 μL染色液(reagent B)到新的1.5 mL离心管，加入990 μL稀释液(reagent C)，混匀后，配成染色工作液，避光待用。小鼠缺血再灌注后，断头取脑(每组4个小鼠大脑)，用冰冻切片机切制成10 μm的冰冻切片，小心加上500 μL预冷的清理液(reagent A)，铺满整个切片表面。移去切片上的清理液(reagent A)后，加上200 μL室温预热的染色工作液，在37℃湿润培养箱里，孵育20 min。避光除去染色工作液后，在整个切片表面加上500 μL清理液(reagent A)，除去切片上的清理液(reagent A)后封片，即刻在荧光显微镜下观察。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平

采用 Western blot分别检测小鼠缺血侧大脑皮层组织中NOX4通路相关蛋白和caspase-3/9 蛋白表达的变化(每组4个小鼠大脑)。利用Bioshine ChemiQ 4600荧光及化学发光成像系统显影后，使用Image J分析软件计算蛋白条带灰度值。

1.3 统计与分析

2 结果

2.1 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织病理学变化的影响

在显微镜下观察发现(图1)，假手术组小鼠脑皮质神经元细胞排列整齐，形态正常且细胞数较多。模型组小鼠脑皮层神经元细胞数量减少，疏松呈网状(黄色箭头所示)，胞核深染(红色箭头所示)等病理性改变。TSG高、中剂量治疗组能够明显减轻小鼠脑皮层神经元的病理性损伤，增加神经元细胞数量，改善神经元细胞形态，减轻核固缩。TSG低剂量组神经元的病理性损伤未得到明显改善。

2.2 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中氧自由基代谢的影响

结果见表1，与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中氧自由基生成明显增加，其氧自由基信号值与假手术组比较呈显著性差异(P< 0.01)；与模型组比较，TSG 12.0、6.0、3.0 mg/kg 可显著抑制小鼠脑组织氧自由基生成，其氧自由基信号值显著下降(P< 0.01或P< 0.05)。

注：A.假手术组；B.I/R组；C.TSG(12.0 mg/kg)组；D.TSG(6.0 mg/kg)组；E.TSG(3.0 mg/kg)组。图1 TSG对小鼠脑I/R损伤后大脑皮层脑组织病理学损伤的影响(×200)Note. A: Sham group. B: I/R group. C: TSG(12.0 mg/kg)group. D: TSG(6.0 mg/kg)group. E: TSG(3.0 mg/kg)group.Figure 1 Effects of TSG on pathological damages in brain tissues after I/R injury in the mice(×200)

表1 二苯乙烯苷对小鼠脑I/R损伤后脑组织氧自由基代谢的影响Table 1 Effects of TSG on metabolism of oxygen free radicals in brain tissue after cerebral I/R injury in the

注：##P< 0.01 vs假手术组；*P< 0.05，**P< 0.01 vs模型组(I/R)。

Note.##P<0.01, vs the sham group.*P< 0.05，**P< 0.01, vs the model (I/R) group.

2.3 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中ROS水平的影响

DHE 染色结果显示，小鼠脑缺血再灌注后，与假手术组相比，模型组小鼠大脑皮质缺血区ROS水平显著增加， TSG (12.0、6.0、3.0 mg/kg) 剂量组小鼠脑皮质缺血区ROS水平较模型组显著降低。提示TSG 可抑制缺血再灌注损伤小鼠大脑皮质ROS的生成。(见图2)

2.4 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中NOX4蛋白表达的影响

小鼠脑缺血再灌注24 h后与假手术组相比，模型组小鼠大脑皮层缺血区NOX4蛋白表达显著上调(P< 0.01)，TSG 12.0 mg/kg和6.0 mg/kg 可显著抑制小鼠大脑皮层缺血区NOX4蛋白的表达，减轻小鼠脑缺血再灌注引起的氧化应激损伤。结果提示TSG可抑制缺血再灌注损伤小鼠缺血区大脑皮质NOX4蛋白表达的增高。(见图3)

注： ##P < 0.01 vs假手术组；*P <0.05，**P < 0.01 vs模型组(I/R)。图3 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中NOX4蛋白表达的影响Note. ##P < 0.01 vs the sham group. *P < 0.05，**P <0.01 vs the model (I/R) group.Figure 3 Effects of TSG on the expression of NOX4 protein in brain tissue after I/R injury in the mice

2.5 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中凋亡相关蛋白表达的影响

小鼠脑缺血再灌注24 h后，与假手术组相比，模型组小鼠缺血区皮层组织凋亡相关蛋白caspase-3/9活化增加，剪切后的caspase-3/9蛋白表达显著增多(P< 0.01)，TSG 12.0 mg/kg可显著抑制小鼠缺血区皮层组织凋亡蛋白caspase-3/9的活化，从而抑制神经元细胞的凋亡。(见图4)

3 讨论

二苯乙烯苷(TSG)化学名为2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，其结构与白藜芦醇相似，仅二位多一个酚羟基并形成了糖苷，均属于二苯乙烯类[13]。在心脑血管方面，Liu等[14]发现TSG的酚羟基通过给出氢原子，自身形成二聚体，从而清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，进而发挥抗氧化作用。此外，TSG可以抑制脑I/R所导致的NMDA受体结合力及神经细胞内钙离子浓度的升高，具有脑保护作用。

大量研究表明，脑缺血后再灌注会进一步加重脑组织损伤，抑制再灌注损伤是治疗缺血性脑血管疾病的重要环节[15-16]。尽管缺血性损伤的病理生理学是复杂且多因素的，但广泛的研究表明氧化应激在I/R损伤中起着重要作用。本研究采用小鼠双侧颈动脉结扎模型观察TSG对脑I/R损伤的作用，结果显示，TSG可以减轻脑I/R造成的脑组织病理性损伤，同时可减少脑组织中氧自由基含量，提示TSG对小鼠脑I/R损伤有保护作用。

注： ##P <0.01 vs假手术组；*P < 0.05，**P < 0.01 vs模型组(I/R)。图4 TSG对小鼠脑I/R损伤后脑组织中cleaved caspase-3/9蛋白表达的影响Note.##P< 0.01 vs the sham group. *P < 0.05，**P < 0.01 vs the model (I/R) group.Figure 4 Effects of TSG on the expressions of cleaved caspase-3/9 proteins in brain tissues after I/R injury in the mice

脑缺血再灌注会引发一系列病理损伤，如兴奋性毒性，炎症反应和氧化应激，最终导致不可逆的神经元损伤[17]，在这些病理事件中，氧化应激已经成为治疗脑血管疾病的主要挑战[18]。大脑中ROS生成涉及许多生物过程，主要来源包括线粒体呼吸链，黄嘌呤氧化酶和环氧合酶，最近的研究表明，NOX也是重要的ROS生产者。Serrano等[19]研究发现：NOX表达和活性在缺血性中风后的神经组织中升高。Qin 等[20]最近研究发现：NOX抑制剂可减少缺血区神经元细胞凋亡、缩小梗塞面积、减轻相应区域功能损伤。本研究结果显示，小鼠脑I/R后缺血区NOX4蛋白表达显著上调，TSG可显著抑制小鼠大脑皮层缺血区NOX4蛋白的表达，减轻小鼠脑I/R引起的氧化应激损伤。上述研究结果均提示了NOX在脑I/R的发病机制中起关键作用，抑制NOX活性可能是减轻脑I/R的有效途径。

Caspase 蛋白家族是细胞凋亡的重要参与者, 其中caspase-9是线粒体内源性凋亡途径的启动者，而caspase-3是凋亡的最终执行者[21]。Caspases-9的活性增高并自我剪切形成cleaved caspase-9，激活下游的caspase-3。凋亡早期caspase-3活化为cleaved caspase-3，裂解相应胞质胞核底物，切割核小体间的DNA，从而诱导细胞凋亡[22]。本研究结果表明，TSG可以显著抑制小鼠脑I/R引起的cleaved caspase-3/9 过度表达，其作用机制可能是下调了NOX4蛋白的表达，抑制ROS爆发性生成，从而抑制线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放和线粒体膜电位(MMP)降低，避免线粒体释放细胞色素C等凋亡因子到胞质激活Caspase系列蛋白。

总之，NOX4是脑I/R损伤中ROS的主要来源，下调NOX4可能是预防氧化应激损伤的有效途径。本研究结果显示，TSG对小鼠脑I/R损伤的保护作用可能与下调NOX4蛋白的表达有关，具体的作用机制我们将做进一步深入研究。