黄芩苷对狼疮鼠肾炎的治疗作用和对滤泡辅助T细胞的调控作用

杨骥 杨雪 杨洁 李明

1复旦大学附属中山医院皮肤科，上海 200032；2复旦大学附属华山医院风湿科，上海 200040；3上海市血液中心 200051

系统性红斑狼疮（SLE）是一种病谱性的自身免疫性疾病，可累及多器官多系统。SLE发病机制复杂，但免疫失衡与其发病密切相关。既往研究揭示，效应性T细胞如分泌白细胞介素17（IL-17）的CD4+T（Th17）细胞、滤泡辅助性T（Tfh）细胞和分泌IL-9的CD4+T（Th9）细胞在SLE患者中增殖，并与狼疮发病密切相关［1-7］。Tfh细胞主要辅助B细胞活化和抗体分泌，其与SLE中自身抗体分泌密切相关，因此可作为SLE的治疗靶点［5-6，8-9］。既往研究表明，黄芩苷具有抗炎和抗变态反应作用，临床一般用于急慢性肝炎的辅助治疗［10-11］。我们前期研究发现，黄芩苷具有免疫调节作用，可促进具有免疫抑制作用的调节性T细胞（Treg）分化，同时抑制Th17细胞分化和促炎效应［12］。但迄今国内外未见黄芩苷对狼疮鼠动物模型体内外Tfh细胞的调控研究。本研究中我们首次通过狼疮鼠模型研究黄芩苷对狼疮肾炎的治疗作用，并研究体内外黄芩苷对狼疮鼠Tfh细胞的调控作用，以进一步明确黄芩苷在SLE临床治疗中的潜力。

材料与方法

一、材料

MRL/lpr狼疮鼠来自上海斯莱克实验动物中心［实验动物生产许可证SCXK（沪）2003-0003；实验动物使用许可证SYXK（沪）2013-0039］，是由于Fas分子表达缺陷、淋巴细胞不能正常凋亡、T和B淋巴细胞异常增殖导致的自身免疫炎症损伤性模型；黄芩苷（相对分子质量446.36）来自上海同田生物技术有限公司（纯度98%，高效液相色谱法测定，生理氯化钠溶液溶解备用）；CD4、C-X-C趋化因子受体5（CXCR5）、程序性死亡蛋白1（PD-1）和IL-21流式细胞仪检测抗体均来自美国BD公司；离子霉素、佛波酯、布雷非德菌素A均来自美国Sigma公司；IL-6和IL-21来自美国Peprotech公司，PBS溶解后使用；抗CD3和CD28抗体来自美国BD公司；尿蛋白检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所。幼稚T细胞分选磁珠来自美国Life Technologies公司；流式细胞仪为美国BD Bioscience公司产品。

二、方法

1.MRL/lpr狼疮鼠和黄芩苷治疗：8只12周龄雌性狼疮鼠饲养在SPF级动物房，体重（29.9±2.6）g，通过随机数字表法随机分为两组，每组4只。前期研究显示，腹腔注射200 mg/kg黄芩苷可有效改善狼疮肾炎病情［12］，因此本次体内实验同样选用200 mg/kg黄芩苷腹腔注射每日1次，治疗4周，对照组同法腹腔注射生理氯化钠溶液。第4周治疗结束时收集24 h尿液，通过考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量。然后处死小鼠，测量体重，摘取小鼠脾脏，从脾脏中分离单个核细胞，用标记抗体异硫氰酸荧光素（FITC）-CD4、别藻蓝蛋白（APC）-CXCR5和藻红蛋白（PE）-PD-1常温避光表面染色20 min，流式细胞仪检测CXCR5+PD-1+细胞在CD4+细胞中的比例。摘取小鼠肾脏，4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后行HE染色，按文献［13］方法评估肾脏损伤情况。

2.体外Tfh细胞培养和流式细胞仪检测：从上述对照组狼疮鼠脾脏中分离单个核细胞，免疫磁珠分选幼稚CD4+T细胞，分为3组进行体外培养，空白对照组不做处理，诱导组加入10 μg/L IL-21、IL-6及3 μg/L抗CD3和CD28抗体培养5 d，干预组在诱导组基础上同时加入40 μmol/L黄芩苷体外培养5 d。用FITC-CD4、APC-CXCR5和PE-PD-1常温避光表面染色20 min，流式细胞仪检测CXCR5+PD-1+细胞在CD4+细胞中的比例。用50 μg/L佛波酯、750 μg/L离子霉素和20 mg/L布雷非德菌素A刺激在上述培养体系中培养的部分幼稚CD4+T细胞5 h后，收集细胞，用FITC-CD4常温避光表面染色20 min，重悬细胞于通透液，PE-IL-21染色20 min，流式细胞仪检测IL-21+细胞在CD4+细胞中的比例。

3.统计分析：采用SPSS20.0软件进行统计。定量资料采用±s表示，通过方差分析和Studentt检验进行统计学分析。显著性水平α=0.05。

结果

一、黄芩苷治疗狼疮鼠狼疮肾炎的疗效

与对照组比较，黄芩苷腹腔注射治疗4周能有效抑制狼疮鼠肾脏炎症细胞浸润程度（图1），黄芩苷组肾脏病理积分为3±0.82，对照组为5±0.82，经Studentt检验，t=2.828，P=0.018；两组24h尿蛋白含量分别为（1 416±171）和（2 623±278）μg/24 h，经Studentt检验，t=6.204，P=0.022。

二、黄芩苷抑制狼疮鼠体内外Tfh分化

黄芩苷组狼疮鼠脾脏重量（0.23±0.04）g，对照组（0.69±0.11）g，经Studentt检验，t=6.618，P=0.07。黄芩苷组狼疮鼠脾脏中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例为12.6%±2.3%，对照组为40.2%±1.1%，两组比较，t=14.9，P=0.005。进一步体外实验证实干预组CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞和CD4+IL-21+细胞比例均低于诱导组（t值分别为2.64、18.03，P＜0.05或0.01）。见表1，图2、3。

图1 黄芩苷治疗狼疮鼠肾炎的疗效（HE×40）1A：对照组；1B：黄芩苷组。黄芩苷组肾小球、肾小管和血管周围炎症细胞浸润程度减轻

讨论

糖皮质激素是SLE目前的主要治疗药物，但长期使用可诱发一系列不良反应。环孢素、环磷酰胺、他克莫司、吗替麦考酚酯、雷公藤和生物制剂等免疫抑制剂也应用于特定类型的SLE治疗，但这些药物常因价格昂贵或严重的不良反应在临床中的使用有限。因此寻找安全、有效且有自主知识产权的治疗药物尤为重要。

SLE发病与自身抗体分泌增多、免疫复合物形成密切相关。Tfh细胞是一群辅助B细胞活化和促进B细胞分泌抗体的重要细胞亚群［9］，主要存在于淋巴滤泡中。许多研究已经证实，SLE患者外周血中存在多克隆Tfh细胞，且与SLE病情活动和自身抗体分泌密切相关，因此Tfh细胞可作为SLE治疗的有效靶点［2，9，14］，抑制Tfh细胞分化和功能可能进一步阻止B细胞活化和自身抗体分泌。

黄芩苷是黄芩素的7-O-葡萄糖醛酸结合物，属黄酮类化合物，既往研究提示，黄芩苷具有保肝、抗炎和抗变态反应作用［15-16］。我们前期证实，黄芩苷可抑制Th17细胞，促进Treg细胞的增生，并可缓解关节炎症损伤［17-18］。本研究中我们发现，黄芩苷可有效降低狼疮鼠24 h尿蛋白含量，缓解狼疮鼠肾脏炎症损伤，抑制狼疮鼠脾脏增生，并有效抑制狼疮鼠中Tfh细胞的增生。进一步体外研究证实，黄芩苷可有效抑制Tfh细胞分化和IL-21产生，提示黄芩苷可能通过抑制Tfh细胞增生和效应发挥治疗狼疮的作用。但是，黄芩苷是否通过氧化应激途径缓解狼疮发病有待进一步明确。总之，黄芩苷具有较明确的抗炎和免疫调节作用，有希望应用于SLE等自身免疫性疾病的治疗。

表1 黄芩苷体外对狼疮鼠Tfh细胞分化的影响（±s，%）

表1 黄芩苷体外对狼疮鼠Tfh细胞分化的影响（±s，%）

组别空白对照组诱导组干预组F值P值只数4 4 4 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞1.8±0.5 17.6±0.9 13.3±0.8 2.64 0.04 CD4+IL-21+细胞0.2±0.1 2.7±0.2 1.0±0.4 18.03＜0.01

图2 流式细胞仪检测狼疮鼠脾脏中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例黄芩苷组狼疮鼠脾脏中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh比例低于对照组。PD-1：程序性死亡蛋白1；CXCR5：C-X-C趋化因子受体5

图3 黄芩苷体外抑制狼疮鼠Tfh细胞分化3A：40 μmol/L黄芩苷对CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞分化的影响；3B：40 μmol/L黄芩苷对CD4+IL-21+Tfh细胞分化的影响。PD-1：程序性死亡蛋白1；IL-21：白细胞介素21