火龙果成年植株茎段直接诱导不定芽快繁体系建立

邓仁菊，范建新，王永清，刘 涛，金吉芬，彭志军

(1. 贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006；2. 贵州省农业科学院 亚热带作物研究所，贵州 贵阳 550006；3. 四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130；4. 贵州省农业科学院 果树科学研究所，贵州 贵阳 550006；5. 贵州省农业科学院 品种资源研究所，贵州 贵阳 550006)

【研究意义】火龙果为仙人掌科三角柱属多年生攀援性肉茎植物，是集水果、花卉、营养、保健于一身的热带亚热带名优水果，也是一种耐瘠、耐旱的高产经济作物[1]。目前，火龙果大田生产主要采用15～20 cm茎段扦插繁殖或直接采用50 cm以上大苗定植[2-3]，但这种方法在遗传母本优良性状的同时，特别容易携带母本病原体，且繁殖效率低下，耗时较长，插枝易于腐烂。组织培养可以在相对较短的时间和有限的空间内，利用较少的原材料快速获得大量健康的无菌苗[4]。【前人研究进展】目前，国内外已有关于火龙果组织培养方面的相关报道，并建立了火龙果快繁的相关体系[5-13]。【本研究切入点】但绝大数有关此方面的研究都是通过种子萌发的子叶、茎段或幼苗等直接诱导成苗[5,8,14-15]，其后代可能会因种子的基因型不同而出现千差万别的类型。另外，不同基因型的火龙果品种对同一培养条件也存在较大差别[16-18]，因此，需要不断改进培养方案来适应更多基因型的火龙果快速增殖。为建立高效的火龙果快繁体系和更好地保存母本优良性状，在前人研究基础上，以不同类型成年火龙果植株为试材，研究了不同生长调节剂及配比、基本培养基浓度、外植体类型等对茎段不定芽诱导的影响，筛选出最适不定芽增殖、生根及移栽的培养条件。【拟解决的关键问题】以期为火龙果的工厂化育苗及采用生物技术遗传改良提供参考和奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以贵州主栽火龙果品种晶红龙、紫红龙和粉红龙3年生成年植株的1年生枝条为试材。

1.2 试验方法

1.2.1 生长调节剂配比对不定芽诱导的影响 以紫红龙火龙果1年生枝条为试材，消毒灭菌后，将外植体切割成约1 cm×1 cm左右大小的茎段，每个茎段带1个完整的刺座，分别接种在MS附加不同浓度6-BA (0.5、1.0和2.0 mg/L)和2, 4-D (0.1、0.2和0.5 mg/L)的培养基上。采用2因素3水平试验设计，共9个处理，每处理接种120个外植体，30 d后统计不定芽诱导率。

1.2.2 基本培养基浓度及外植体类型对不定芽诱导的影响 以紫红龙火龙果1年生枝条为试材，消毒灭菌后，将外植体切割成3种类型：带刺座含小刺和绒毛的茎段、带刺座抹掉小刺和绒毛的茎段和不带刺座茎段，然后分别接种于不同浓度(MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS)的基本培养基上，共12个处理，每处理接种90个外植体，30 d后统计不定芽诱导率。

1.2.3 不同基因型火龙果对不定芽诱导的影响 以晶红龙、紫红龙和粉红龙3种不同基因型火龙果成年植株的1年生枝条为试材，消毒灭菌后，将外植体切割成1 cm×1 cm左右大小的茎段，每个茎段带1个完整刺座，接种在MS+6-BA 2.0 mg/L+2, 4-D 0.1 mg/L培养基上，共3个处理，每处理接种120个外植体，30 d后统计不定芽诱导率。

1.2.4 火龙果不定芽的增殖培养 不定芽的增殖培养基以MS附加不同浓度的6-BA (0.5、1.0和2.0 mg/L) 、NAA (0.1、0.2和0.3 mg/L)和Tryptone (250、500和750 mg/L)。采用3因素3水平正交试验设计，共9个处理，每处理接种45个外植体。接种后观察并记录芽苗增殖及生长情况，培养30 d后统计其增殖系数和芽苗长势。

1.2.5 火龙果不定芽的生根培养 当增殖的丛芽长到2 cm左右时，将其切割成单个转接到生根培养基上。生根培养基以MS附加不同浓度的6-BA (0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L)、NAA (0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L)、CCC (矮壮素，0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L)及AC(活性碳，0、0.01、0.03和0.05 mg/L)。釆用4因素4水平试验设计，共16个处理，每个处理接种135个外植体。培养30 d后统计生根率、平均生根条数及平均根长。

1.2.6 火龙果炼苗与移栽 移栽前，在培养室内将生根后的无菌苗揭膜炼苗3～5 d后从瓶中取出，清洗干净根部的培养基；移栽时，先用0.2 %多菌灵消毒处理基质，再将其装入塑料盆中，每盆移栽1株苗，置温室中培养，每15 d喷施0.1 %～0.2 %的磷酸二氢钾溶液1次，60 d后统计其成活及生长情况。

1.3 数据处理与统计分析

不定芽诱导率 = (诱导出不定芽的外植体/接种成活的外植体)×100 %

不定芽增殖系数 = 增殖总芽苗数/接种前芽苗数

生根率= (生根无菌苗/接种无菌苗)×100 %

移栽成活率=(移栽成活数/移栽总数)×100 %

所有数据均采用EXCEL 2016和DPSv 7.05进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 火龙果不定芽的诱导情况

2.1.1 生长调节剂配比对火龙果不定芽诱导的影响 从表1和图1看出，不同生长调节剂浓度及配比对外植体的成活及不定芽诱导都有一定影响。以外植体的成活数量为基数，各处理中不定芽的诱导率都在70 %以上。外植体成活率最高的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，达93.3 %；不定芽诱导率最高的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，达89.1 %。

2.1.2 基本培养基浓度和外植体类型对不定芽诱导的影响 从表2看出，外植体含有小刺和绒毛的完整刺座，其不定芽诱导率显著高于抹去小刺和绒毛的外植体，不带刺座的外植体没有诱导出不定芽。另外，无论外植体是否去掉刺座，均以MS基本培养基的不定芽诱导率最高，且显著高于1/2MS、1/4MS和1/8MS。

表1 不同生长调节剂配比火龙果不定芽的诱导情况

注：同列不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same as below.

表2 不同基本培养基和外植体类型火龙果不定芽的诱导情况

2.1.3 不同基因型外植体对不定芽诱导的影响 从表3看出，对于3种不同类型的外植体，茎段接种后一般在18～25 d开始出新芽，且不定芽的诱导率均在80 %以上。其中，紫红龙茎段的不定芽诱导率最高(88.2 %)，出芽时间最早，接种18 d左右，刺座处开始冒出新芽点。晶红龙和粉红龙茎段的不定芽诱导率没有显著差异，但出芽时间以晶红龙早于粉红龙。

图1 火龙果茎段直接诱导不定芽的生长情况Fig.1 Induction of adventitious bud directly from stem of mature pitaya

表3 不同基因型外植体火龙果不定芽的诱导情况

表4 不同处理火龙果不定芽的增殖培养情况

注：表中“+”为芽苗生长差，“++”为芽苗生长一般，“+++”为芽苗生长良好，下同。

Note: +, ++ and +++ represent poor growth, general growth, good growth respectively. The same as below.

2.2 火龙果不定芽的增殖培养情况

火龙果不定芽转接至增殖培养基中10～15 d后，不定芽的刺座处开始萌动；培养30 d左右时已形成丛生芽。从表4看出，不同生长激素浓度及配比对火龙果不定芽增殖的影响差异较大，当MS培养基中附加6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L时，不定芽的增殖系数最高，为 5.74，长势较好(图2A)；其次为MS培养基附加 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ Tryptone 250 mg/L时，增殖系数为 5.36；MS培养基附加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0. 5 mg/L+Tryptone 250 mg/L时，增殖系数最低，仅1.93，不定芽长势相对较弱(图2 B )。结合增殖系数及不定芽长势认为，适宜试验火龙果不定芽增殖的培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1～0.2 mg/L+Tryptone 250～500 mg/L，增殖系数都在5.0以上。

2.3 火龙果不定芽的生根培养情况

将不定芽接种在含不同生长调节剂浓度的培养基上，15 d左右开始长根。由表5可知，在适宜的培养基中添加一定浓度的活性碳 (AC) 有利于促进生根，而添加一定浓度的矮壮素 (CCC) 有利于芽苗的粗壮。当MS培养基附加生长调节剂6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L+CCC 0.5～1.0 mg/L+AC 0.03 %～0.05 % 时，不定芽的生根率在98 %以上，平均生根条数6.8～7.0条，平均根长6.7～7.4 cm，根和苗都生长健壮(图3)；MS培养基附加生长调节剂6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+CCC 1.5 mg/L的火龙果不定芽生根率最低，仅34.3 %，平均生根条数和平均根长分别为2.8条和6.6 cm，根和苗的长势一般。

图2 火龙果不定芽分化及生长Fig.2 Adventitious bud differentiation and growth of pitaya

表5 不同生长调节剂浓度配比火龙果的生根情况

2.4 火龙果的炼苗与移栽情况

从表6和图4看出，无菌苗对环境的适应能力较强，各处理火龙果无菌幼苗的成活率均在85 %以上。成活率带根移栽苗的略高于不带根移栽苗的。总的来讲，珍珠岩∶腐殖土为2∶1和蛭石∶腐殖土为1∶1处理移栽的无菌苗全部成活，60 d的平均生长高度为3.5 cm；仅用珍珠岩移栽的无菌苗成活率最低，为86.7 %，60 d后平均生长高度为1.2 cm；直接采用大田土移栽成活率也能完全成活，但生长相对缓慢。

3 讨 论

前期研究表明，采用火龙果成年植株茎段诱导愈伤组织进行再分化比较困难[19]，且直接利用茎段诱导不定芽再进行快繁增殖的研究相对也较多。结果表明，外植体上保留完整刺座，即带小刺和绒毛，其不定芽诱导率最高 (85.1 %)，显著高于带刺座而抹掉刺座上小刺和绒毛的外植体；不带刺座的外植体不能直接诱导出不定芽。研究结果与彭绿春等[12]的研究结论相似，这可能由于刺座处含有不定芽生长的原基，在抹掉刺座处的小刺和绒毛过程中，可能会对不定芽原基造成一定损伤，或直接拔掉了不定芽原基，而影响不定芽的再生。另外，植物生长调节剂也是影响不定芽诱导成功率的主要因素之一。周传明等[20]的结果表明，MS基本培养基附加生长调节剂6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L时，有利于提高不定芽的诱导率；MS培养基附加生长调节剂6-BA 12.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L时，有利不定芽的诱导增殖和继代培养。彭绿春等[12]的研究表明，适宜火龙果不定芽诱导的培养基为MS+6-BA 2～4 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+TDZ 0.4～0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导成功率达80 %；不定芽增殖系数最高的培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖系数可达6.4。HUA等[10]研究认为，ZT生长素对茎段不定芽的诱导和生长具有明显促进作用，效果优于常规用的TDZ、6-BA和2,4-D等植物生长调节剂。研究结果与彭春绿[12]的较接近，茎段不定芽诱导率最高的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；不定芽增殖系数最高的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L。不同基因型的火龙果外植体，在同一培养基中的不定芽诱导率也存在一定差异，这可能与不同的基因调控有关[9]。总的来讲，3种基因型的火龙果茎段不定芽的诱导率都在80 %以上，以红皮红肉型的紫红龙火龙果茎段的不定芽诱导率最高，红皮白肉型的晶红龙和红皮粉肉型的粉红龙火龙果茎段的不定芽诱导率差异不明显。另外，相对其他植物而言，火龙果无菌苗的生根和移栽都较容易，即使未带根移栽成活率也在90 %以上，说明火龙果对土壤环境的适应力较强，但在透气性较好的土壤中生长更佳。

图3 火龙果不定芽生根培养Fig.3 Rooting culture of adventitious buds of pitaya

表6 不同基质配比处理火龙果无菌幼苗的生长情况

4 结 论

通过火龙果成年植株茎段直接诱导不定芽的研究表明，利用带完整刺座(包括小刺和绒毛)的茎段直接诱导不定芽的成功率较高，培养周期较短，生根移栽较易；不带刺座的茎段不能直接诱导出不定芽。适宜火龙果不定芽诱导的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L，不定芽增殖系数最高的培养基为MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L；适宜不定芽生根的培养基为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L+CCC 0.5～1.0 mg/L+AC 0.03 %～0.05 %；基质采用珍珠岩∶腐殖土为2∶1或蛭石∶腐殖土为1∶1进行配比，火龙果无菌幼苗移栽成活率最高、长势较好。

图4 火龙果无菌苗炼苗与移栽Fig.4 Climatization and transplanting of pitaya plantlets